İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

İnsan beynindeki nöronal spesifik gen ekspresyonunu yöneten kromatin DNA etkileşimlerini incelemek için, bunu yapmak için önce saf bir nöronal çekirdek popülasyonu elde edilmelidir. Postmortem insan beyin dokusu homojenize edilir ve toplam çekirdekler yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak izole edilir. Daha sonra çekirdekler, akış metrik sıralama yoluyla izole edilen nöronal spesifik antikorlarla etiketlenir ve son olarak ultrasantrifüjleme ile konsantre edilir.

Merhaba, ben Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi psikiyatri bölümünde Dr.Sharon mc Barian'ın laboratuvarından Anish Matan. Bugün size ölüm sonrası insan beyin dokusundan nöronal çekirdek izolasyonu için bir prosedür göstereceğim. Öyleyse başlayalım.

Sıralanacak her çekirdek örneği için, bin miligram donmuş ölüm sonrası beyin dokusu ile başlayın. Bu miktarla, floresan ile aktive edilmiş sıralamadan sonra yaklaşık 5 milyon nöronal çekirdek elde edebilirsiniz. Çekirdek ekstraksiyonuna başlamak için, 250 miligram beyin dokusunu beş mil lizis tamponu içeren bir aşağı indiriciye yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.

Doku buz üzerindeyken bir dakika boyunca çözülür. İndirdikten sonra, homojenize dokuyu 15 mil berrak bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından tüpü buzun üzerine koyun. Kalan doku için bu homojenizasyonu tekrarlayın.

Daha sonra, homojenize doku çözeltisi sakaroz çözeltisinin üzerinde olacak şekilde bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için ultrasantrifüj tüplerinin dibine dokuz mil sükroz çözeltisini dikkatlice pipetleyin. Şimdi, ultrasantrifüj sırasında dengeli olduklarından emin olmak için ultrasantrifüj tüplerini tartın. Üst katmana lizis tamponu ekleyerek ağırlıkta herhangi bir ayarlama yapın Tüpler tartıldıktan sonra, SW 28 rotor ultrasantrifüj örneklerini kullanarak ultrasantrifüje yerleştirin 107163.6 RCF'de dört derecede 2.5 saat.

Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, snat'ı ve konsantrasyon gradyanında bulunan kalıntı tabakasını aspire edin. Çekirdeği içeren tüpün alt kısmındaki peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Ardından, her pelete 500 mikrolitre bir XPBS ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde bekletin.

20 dakika sonra, tekrar peletleri yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alın. Buz üzerindeki inkübasyon, peletlerin kendi başlarına biraz çözünmesine izin verir, bu da çekirdeklerin yeniden süspanse edilmesini kolaylaştırır, böylece çekirdeğin yaşadığı stres miktarını azaltır. Daha sonra resus süspansiyonunu ve çekirdekleri iki mil santrifüj tüpüne aktarın.

Nükleik çözeltiyi iki ultra santage tüpünden her bir mikro santrifüj tüpüne birleştirin ve numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin. Artık nükleik ekstraksiyon tamamlandığına göre, nöronal çekirdekleri izole etmek için immüno-boyama adımına geçeceğim, aslında çekirdek içeren numunenin sıralanması, birincil ve ikincil antikordan oluşan bir immüno-boyama karışımı ile inkübe edilecek ve ayrıca immüno-boyama karışımını 1.2 mikrolitre nöronal spesifik antikorda yeni N ila 300 mikrolitre bir XPBS'de yapmak için bağlantıları bloke edecek. Ardından, bir XPBS'de% 0.5 BS, A ve% 10 normal kod serumu içeren yüz mikrolitre bloke edici karışım ekleyin.

Son olarak, LOR 4 88 adı verilen ikincil antikorun bir mikrolitresini ekleyin. Ayrıca bu immüno-leke karışımı için negatif bir kontrol numunesi için bir immüno-boyama hazırlayın. Birincil antikor yeni ucunu hariç tutun ve 1.2 mikrolitre bir XPBS ile değiştirin.

Şimdi immüno-boyama karışımlarını girdaplayın ve boyama karışımları inkübe edilirken karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Negatif kontrol numunesi Eloqua 20 mikrolitre resus span çekirdeği için kontrol çekirdeği numunelerini, 980 mikrolitre bir XPBS içeren iki millik bir tüpe hazırlayın. Ayrıca, yalnızca çekirdek çözeltisini ve PBS'yi içeren lekesiz bir kontrol hazırlayın.

Şimdi Eloqua 20 mikrolitre çekirdeği başka bir tüpe koyun ve bir XPBS ile sesi bir mil'e kadar yükseltin. Ardından tüm numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin. Şimdiye kadar immüno-boyama karışımları tamamlanmıştır.

İnkübasyon: Uygun numuneye 401 mikrolitre karışım ekleyin. Çekirdek numunesi, hem yeni hem de LOR 4 88 içeren karışımı aldı. Negatif kontrol numunesi, sadece ikincil antikor LOR 4 88 içeren bir karışım alırken, boyanmamış kontrol numunesine immün boya eklenmez.

Daha sonra, numuneleri coldron'a aktarın ve karanlıkta 45 dakika döndürün. Artık 45 dakikalık inkübasyon tamamlandığına göre, numuneleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi akış sitometrisi çekirdek tesisine götüreceğim ve bazı floresan aktif sıralama yapacağım Çekirdek tesise taşıma sırasında, numuneler buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır. Akış sitometrisi çekirdek tesisinde, numuneler önce 40 mikronluk bir filtreden süzülür ve daha sonra soğuk tutulurken birkaç dakika boyunca cihazdan geçirilir.

Bu, sıralamadan önce bazı ön veriler elde etmek için yapılır. Lekesiz kontrol, negatif floresan derecesini belirler. Bu bilgilere dayanarak, makinenin hassasiyetini floresansa göre ayarlayın.

Lekeli kontrol, gribi kontrol etmek için kullanılır. Bu noktada floresan çıkmasından kaynaklanan herhangi bir arka plan gürültüsü, sıralama için gereken uygun kapıları ayarlayın. Numuneleri sıralamak için birkaç farklı kapı kullanılır.

İşte ilk geçit için bazı tipik veriler. Bu faks analiz tablosu, kapı ayarlandıktan sonra temsili bir örnek gösterir. İlk kapı, floresan ve genel görsel deneyim gibi ayarların bir kombinasyonuna dayalı olarak enkaz ve canlı çekirdek modellerini tanır.

X ekseni, göreli boyuta karşılık gelen ileri saçılmayı temsil ederken, Y ekseni, ayrıntı düzeyi gibi iç karmaşıklığı açıklayan site dağılımını açıklar. İlk kapı, örneğimizde bulunan farklı çekirdeklerin boyutu hakkında da bir fikir verebilir. Bu, enkazı gerçek çekirdeklerden ayırmaya izin verir ve işte ikinci kapıdan bazı tipik veriler.

Bu faks şeması, herhangi bir agregayı atarken çekirdekleri ayrı ayrı sıralamaya izin veren ikinci bir kapı örneğini göstermektedir. Bu kapı, çekirdeklerin lazerden geçmek için harcadıkları süredeki farklılıklara bakar. Agrega olanların geçmesi normalde daha uzun sürer.

Bu özel parametre çok önemlidir, çünkü agregaların dahil edilmesi saflığa müdahale edebilir, çünkü bazı floresan çekirdekler floresan olmayanlara bağlanabilir. Son olarak, işte üçüncü kapıdan tipik veriler. Bu kapı, ikincil antikorumuzda bulunan floronunkiyle eşleşen spesifik bir floresan dalga boyuna ayarlanmıştır.

Bu faks tablosunda, x ekseni boyunca floresan seviyesini ve Y ekseni boyunca koyu kırmızı bir kanal dedektörü, PECY yedi görüyorsunuz. Bu nokta lekeleri, tek bir renk histogramıyla karşılaştırıldığında daha iyi bir görsel sağlar. SCADA'nın yerleştirilmesi, yeni ve pozitif nöronal çekirdeklerin yeni ve negatif nöronal olmayan çekirdeklerden sıralanmasına ve ayrılmasına izin verir.

Tüm kapılar seçildikten sonra, çekirdekler tek bir XPBS'ye sıralanır. Tüm numune olgu sıralamasından geçtikten sonra, sıralanan numunenin bir Eloqua'sını cihazdan geçirerek sıralamanın saflığını kontrol edin. İşte en iyi sonucun bir örneği.

Burada, karışık bir çekirdek popülasyonu içeren presort örneğini, negatif çekirdeklerin çoğunu ortadan kaldıran sıralanmış Eloqua ile karşılaştırın. Saflık yüzdelerinin, ayarlanan kapılara dayalı olarak numuneyi kirleten olayların sayısına dayandığını unutmayın. Numune makineden ilk kez geçirildiğinde, bir miktar ağartma meydana gelebileceğini, dolayısıyla bunu hesaba katmak için bir miktar kararmaya neden olabileceğini, bazı ayarlamaların yapılması gerekebileceğini unutmayın.

Numune sıralandıktan sonra çekirdekleri işlemeye başlayın. Bunu yapmak için, sıralanmış numuneden 10 mil alın ve iki mil sükroz çözeltisi, 50 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ve 30 mikrolitre bir molar magnezyum asetat ekleyin. 10 milden az sıralanmış numune varsa, bir XPBS ekleyerek sesi 10 mil'e yükseltin veya ek malzemeleri buna göre ayarlayın.

Ardından, numuneyi birkaç kez ters çevirin ve 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. 15 dakika sonra, dört derecede 15 dakika boyunca bir döner kova rotoru 1, 786 RCF'de santrifüj özellik örneği. Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde bulunan beyaz peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Daha sonra peleti, önceki deneyler için gerekli olan uygun çözeltinin 200 mikrolitresinde çözün. Bu durumda, sonraki çip deneyi için pelet ve indirme tamponunu çözüyoruz. Ardından peleti boru ile yukarı ve aşağı yeniden askıya alın.

Bu noktada, çekirdekleri daha küçük bir tüpe aktarabilir ve eksi 80 derecelik bir dondurucuya yerleştirebilirsiniz. Daha fazla kullanana kadar, size nöronal çekirdekleri insan ölüm sonrası beyin dokusundan nasıl izole edeceğinizi gösterdim. Bu çekirdeklerle, kromatin immünopresipitasyonu gibi bir dizi farklı analiz yapabilirsiniz.

Bu prosedürü yaparken, nükleer sabitlenmediğinden ve uzun sıcaklıkta bozulabileceğinden, numunelerinizi her zaman buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, insan dokusunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek güvenlik standartlarında ele alınması önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.