Name: İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin, postmortem insan beyin dokusundan nöronal çekirdek izolasyonu için homojenizasyon, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ve akış sitometrisi yöntemlerini. Bu teknik, nöron spesifik gen ekspresyonu ve epigenetik araştırmaları ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Sitometrisi Core tesiste Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Dr. Richard Konz ve personel tarafından sağlanan danışmanlık ve teknik destek için teşekkür ederiz. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi Hibe DK032520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır. Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (NIMH), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü&#39;nden (NIDA) ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir.

Çekirdekler Ekstraksiyon <ol><li> Bir douncer 5 ml Lizis Tampon 1, 250 mg donmuş postmortem beyin dokusu koyun ve buz üzerine yerleştirin. Sıralama FACS sonra yaklaşık 5 milyon çekirdekleri almak için, genellikle örnek başına 1000 mg doku kullanın. </li><li> Doku çözülmüş sonra, buz üzerinde ise 1 dakika için doku Dounce. </li><li> Homojenize doku ve 15 ml açık ultrasantrifüjdeki tüp içine yerleştirin. Buz tüpü koyun. </li><li> 9 Sakkaroz Çözüm 2 mL pipet ile alın açık ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde pipet koymak ve Sakkaroz Çözüm 2 üstüne homojenize doku çözümü ile bir konsantrasyon degrade oluşturmak için Sakkaroz Çözüm 2 serbest. </li><li> Ultrasantrifüjdeki içinde dönerken tüm dengeli olacağına emin olmak için ultrasantrifüjdeki tüpler tartılır. Lizis Tampon 1, üst tabaka eklenerek ağırlığı herhangi bir ayarlamaları yapın . </li><li> Tüpler tartılır sonra, rotor kova içine koyun. </li><li> SW28 rotor içine yerleştirin ve tüm kovalar rotor ultrasantrifüjdeki dikkatlice yerleştirin. </li><li> 4 2,5 saat süreyle 107163,6 RCF örnekleri ultrasantrifüjdeki ° C </li><li> Tüpün alt kısmındaki çekirdekleri içeren pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, bir vakum kullanımı ile, konsantrasyon farkı Bulunan enkaz tabakası ile birlikte, süpernatant kaldırmak. </li><li> 1X PBS 500 mcL her pelet ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu pelet, daha sonra mekanik stres miktarını azaltır çekirdekleri deneyimi, yukarı ve aşağı pipetleme çözmek için kendi başına çözmek için biraz izin verir. </li><li> Çekirdekleri, 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra, mekanik 1XPBS içinde çekirdekleri tamamen erimesi için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Çekirdekleri içeren çözüm ultrasantrifüjdeki tüpleri çıkarın ve 2 mL tek mikrosantrifüj tüpe iki tüp içeriğini birleştirmek. Yine, buz örnekleri yer. </li></ol> FACS için immün <ol><li> Bu noktada, birincil ve ikincil antikor oluşan bir immün karışımı yapmak ve Engelleme karıştırın. Her bir numune için 300, 1.2 Neun antikor,% 0.5 BSA ve% 10 Normal Keçi 1XPBS Serum ve Alexa Fluor 488 1 mcL içeren Engelleme Mix, 100 mcL mcL içeren 1XPBS mcL birleştirir. Kontrol örnekleri için, birincil antikor Neun dışlamak yerine, sadece daha fazla 1XPBS eklemek. </li><li> Vorteks immün karışımı 5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Boyama karışımı inkübe iken, numuneler için kontrollerini yapmak. Yalnız çekirdekleri içeren bir örnek sıralama FACS için, &quot;lekesiz kontrol&quot; tabi olarak adlandırılan ikinci bir örnek, bir negatif kontrol, birincil antikor Neun de tabi olmadan ikincil antikor Alexa Fluor 488 çekirdekleri içeren. </li><li> 980 uL negatif kontrol 1XPBS içeren başka bir 2 ml tüp içine 1XPBS lekesiz kontrolü için, ve başka bir 20 mcL içeren 2 ml mikrosantrifüj tüpe çözüm içeren çekirdeğinin kısım 20 mcL. Hacmi çekirdekleri içeren 1XPBS 1 ml yedeklemek örnek kaldırın. Tüm numuneler, buz üzerinde geri yerleştirilir. </li><li> Immün karışımı inkübe tamamladı Şimdi uygun numuneler 401 mcL içeriğini ekleyin. Olumsuz örnek içeren karışımın sadece ikincil antikor Alexa Fluor 488 alacaksınız çekirdekleri örnek, hem Neun ve Alexa Fluor 488 içeren karışım alacaksınız. </li><li> 45 dakika boyunca karanlıkta döndürmek için soğuk oda içine örnekleri alın. </li><li> Örnekleri 45 dakika boyunca karanlıkta inkübe sonra, buz koyun ve FACS tesisi getirin. FACS tesisine taşıma sırasında, örnekleri, buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır. </li></ol> FACS <ol><li> FACS tesiste, 40 um filtresi aracılığıyla numuneler filtre. Sonra, soğuk tutuluyor sıralamadan önce bazı ön verileri elde etmek için, onları bir kaç dakika aracı ile çalışacak. </li><li> Bu noktada, bu sıralama için gerekli olan uygun kapılarını ayarlamak için gereklidir. Birkaç ayrı ayrı kapılardan tür örnekleri için kullanılır. Ilk kapısı örnek içinde bulunan farklı çekirdeğinin boyutu hakkında bir fikir verir ve gerçek çekirdekleri enkaz separatation sağlar. İkinci kapı bizi tek tek çekirdekleri sıralamak için izin verir. Bu noktada atın herhangi bir agrega atılır. Son olarak, üçüncü kapı bizim sekonder antikoru bulundu florokrom bu eşleşen, belirli bir floresan dalga boyu ayarlanır. Bu kapıdan yerleştirilmesi bize düzenlemenize olanak sağlar ve bu nedenle ayrı Neun + Neun nöronal çekirdeklerin çekirdekleri. </li><li> Bütün kapıları seçilmiştir sonra, çekirdekleri 1XPBS sıralanabilir. </li><li> Sonratüm örnek geçti, aracı ile sıralanmış örnek bir kısım çalışan tür saflık kontrol edin. Örnek floresan yayılmamış değil, tek bir kadran içinde yer emin olun. % 90&#39;ın üzerinde saf örnekleri seçmek için en iyisidir. </li></ol> FACS sonra <ol><li> Örnek çekirdekleri işleme başlayabilirsiniz sıralanır olmuştur. 10 ml sıralaması örnek alın ve Sakkaroz Çözüm 2 uL 1M CaCl 2, 50 ve 30 ul 1m Mg (As) 2 2 mL ekleyin. Bir hatırlatma olarak, her zaman örnek çekirdekleri Sabitlenmemiş beri buz üzerinde tutmak için emin olun. </li><li> Az 10 ml sıralaması örnek varsa, 1XPBS ekleyerek 10 ml sesini yükseltmek, ya da ek maddeler buna göre ayarlamak. </li><li> 15 dakika boyunca örnek birkaç kez buz üzerinde ve yerde tersine çevirin. </li><li> , 4, örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra 15 dakika boyunca 1786 RCF bir salıncak kova rotor santrifüj ° C </li><li> Borunun alt kısmında bulunan beyaz pelet bozmadan, bir vakum kullanımı ile süpernatant atın. </li><li> 200 ul geçmeden deneyler için gerekli her türlü çözüm pelet çözülür ve pipet ve aşağı yukarı. </li><li> Çözüm küçük bir tüp içine aktarın ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C derin dondurucu içine yerleştirin. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

Burada sunulan protokol daha genel nöronal kromatin epigenetik değişiklikler ve odaklanmış çalışmaları için özellikle yararlı olacaktır, normal gelişmekte olan ve yaşlanma veya nörolojik veya psikiyatrik bir hastalık sırasında nöronal çekirdeği, moleküler fenotipi. Bu yöntem, potansiyel yaşlanma seyri sırasında nöron glia rasyon vardiya veya hastalık nedeniyle beyin dokusunda hücresel heterojenite bir endişe 1 belli bir avantajdır . Örneğin, bugünkü sıralama protokolü kromatin immunoprecipitation teknikleri ile birleştirerek, son...

Reaktifler: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lizis Tampon </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sakaroz </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Asetat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0.1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> % 0.1 </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 50 ml hacim ayarlayın </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Sakkaroz Çözüm </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sakaroz </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Asetat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 50 ml hacim ayarlayın </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Tampon Dounce </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0.163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 200 ml pH 7.5 ve hacmi ayarlayın. </td></tr></table>

İnsan postmortem beyin dokusu nöronal Çekirdekler İzolasyon

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Insan beyninin nöron prenatal gelişimi sırasında büyük ölçüde postmitotic hale gelir, ve böylece tam ömrü boyunca çekirdekleri korumak. Ancak gelişme ve yaşlanma ders sırasında nöronal kromatin ve nükleer organizasyon değişiklikleri veya kronik nöropsikiyatrik hastalık hakkında bilinen çok az. Ancak bugüne kadar, en Kromatin ve DNA tabanlı testlerin (FISH dışında) eksikliği, tek hücreli çözünürlük. Nöronların genellikle çeşitli alt popülasyonlar glia ve diğer non-nöronal hücrelerin farklı türleri ile iç içe, çünkü bu amaçla, beyin dokusu önemli hücresel heterojenite, önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Hücre türüne özgü kültürleri büyümeye olası bir çözüm olurdu, ama nöronlar da dahil olmak üzere en çok merkezi sinir sistemi hücreleri, sadece birkaç hafta için, en azından, sürdürülebilir ex vivo ve böylece potansiyel olarak tam ömrü boyunca faaliyet epigenetik mekanizmalar için eksik bir model sağlayacak . Burada, (sabit asla) dondurulmuş insan postmortem beyin çekirdeklerinin özü ve arındırmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, anti-neun antikor ile Ultrasantrifügasyon ve immunotagging takip Hipotonik lizis tamponu çekirdeklerinin çıkarılması içerir. Etiketli nöronal çekirdeklerinin daha sonra floresan aktive sıralama kullanılarak ayrı toplanır. Bu yöntem, türlerin geniş bir yelpazede herhangi bir beyin bölgesi için geçerli olup, site ve modifikasyon özgü anti-histon antikorlar ve DNA metilasyon ve diğer testleri ile kromatin immunoprecipitation çalışmalar için uygun olmalıdır.

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

İnsan beynindeki nöronlar, büyük ölçüde prenatal gelişim sırasında postmitotik hale gelirler ve bu nedenle tüm yaşam süresi boyunca çekirdeklerini korurlar. Ancak, ...

İnsan beynindeki nöron spesifik gen ekspresyonunu yöneten kromatin DNA etkileşimlerini incelemek için, öncelikle saf bir nöronal çekirdek popülasyonu elde edilmelidir. Postmortem insan beyin dokusu homojenize edilir ve toplam çekirdekler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu kullanılarak izole edilir. Ardından, çekirdekler nöron spesifik antikorlarla işaretlenir, akış metrik ayıklama (flow metric sorting) yoluyla izole edilir ve son olarak ultrasantrifüjasyon ile konsantre edilir.Merhaba, ben Massachusetts Tıp Üniversitesi Psikiyatri Bölümü'nde Dr. Sharon McBarian'ın laboratuvarından Anish Matan. Bugün size postmortem insan beyin dokusundan nöronal çekirdek izolasyonu prosedürünü göstereceğim. Haydi başlayalım.Sıralanacak her çekirdek örneği için, bin miligram dondurulmuş postmortal beyin dokusuyla başlayın. Bu miktarla, floresan aktifleştirilmiş sıralama sonrası yaklaşık 5 milyon nöronal çekirdek elde edebilirsiniz. Çekirdek ekstraksiyonuna başlamak için, beş ml lizis tamponu içeren bir dövme tüpüne 250 miligram beyin dokusu yerleştirin ve buz üzerine koyun.Doku çözüldüğünde, buz üzerinde bir dakika boyunca homojenize edin. Homojenizasyon işleminden sonra, homojenize edilmiş dokuyu 15

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Bu videoda, taze donmuş glioma dokusundan tek çekirdekleri izole etmek için kullanılan protokol açıklanmaktadır. İzole edilmiş tek çekirdekler, merkezi sinir dokularının gliomunda gözlenen tümörler arası ve tümör içi heterojenlik hakkında daha derin bilgiler elde etmek için tek çekirdekli RNA (snRNA) dizilemesi ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin (snATAC) dizilemesi için tek çekirdekli Test gibi dizileme teknikleri için örnekler olarak kullanılabilir.

Taze Donmuş Glioma Dokularından Çekirdek İzolasyonu: Glioma Tümör Örneklerinden Sağlam Çekirdek Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Video, fare hipokampal dentat girusundaki (DG) glial ve kök hücrelerden sağlam çekirdekleri izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. DG dokusu, çekirdekleri serbest bırakmak için soğuk bir homojenizasyon tamponunda mekanik olarak ayrışır. Doku kalıntıları ve salınan diğer organeller atılır ve çekirdekler bir DNA boyası ve nöronal nükleer antijene (NeuN) özgü florofor konjuge bir antikor ile boyanır. Floresanla aktive edilen çekirdek sınıflandırması daha sonra nöronal olmayan hücrelerin...

Hipokampal Dentat Girus'taki Nöronal Olmayan Hücrelerden Çekirdekleri İzole Etme Tekniği

Bu video, çeşitli nörolojik uygulamalar için farklı hücre popülasyonlarının incelenmesini sağlayan floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS) kullanarak taze donmuş insan beyin dokusundan çekirdekleri izole etme ve ayırma prosedürünü göstermektedir.

Floresanla Aktive Edilen Çekirdek Sıralaması Kullanılarak Beyin Dokusundan Hücre Popülasyonlarının İzole Edilmesi

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

Burada, floresan ile aktive olmuş çekirdekler (FAN) sıralama yoluyla çoğu nöronu dışlayan fare dentat girusundan izole edilen tek çekirdekleri sıralamak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ekspresyon profilleri oluşturur ve nöral kök hücreler gibi kıt popülasyonlar da dahil olmak üzere niş içinde temsil edilen diğer hücre tiplerinin çoğunun incelenmesini kolaylaştırır.

Hipokampal Nörojenik Nişi İncelemek için Tek Çekirdekli RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Negatif Nöronik Sıralama

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Öğrenin, postmortem insan beyin dokusundan nöronal çekirdek izolasyonu için homojenizasyon, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ve akış sitometrisi yöntemlerini. Bu teknik, nöron spesifik gen ekspresyonu ve epigenetik araştırmaları ilerletir.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Daha fazla video keşfet