Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

Dowling laboratuvarında, hareketleri algılayamayan zebra balığı mutantlarının ışığı algılayıp algılayamadığını ve kör olup olmadıklarını belirlemek amacıyla zebra balıklarının retinasının fizyolojisini ve gelişimini inceliyoruz. Bunu yapmak için görsel motor yanıtlarını (VMR) test ediyoruz. Zebra balıklarını döllenmeden yaklaşık dört gün sonra topluyoruz.

Bunları 96 kuyucuklu plakalara yerleştirin, uygun bir görüntüleme düzeneği hazırlayın, video takip yazılımını plaka ile hizalayın ve ardından ışıktan karanlığa veya karanlıktan ışığa geçişler sonrası balıkların motor yanıtını takip edin; biz buna VMR diyoruz. Merhaba, ben Harvard Üniversitesi'ndeki John Dowling laboratuvarından ve Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Farida Imran.

Ben Jason Rio. Harvard Üniversitesi'ndeki moleküler ve hücresel biyoloji bölümünde, Alexander Shear'ın laboratuvarındayım. Bugün size, ışık artışlarına ve azalışlarına karşı zebrafishlerdeki görsel motor yanıtı göstereceğiz.

Haydi başlayalım. Görsel motor yanıt deneyi ile başlamak için öncelikle, vahşi tip zebrafish larvalarını, döllenmeden sonraki en az dördüncü güne kadar 28 °C'de, karanlık-aydınlık döngüsü altında büyütün. En iyi davranışsal sonuçlar için tipik ışık-karanlık döngümüz, sabah saat 09:00'da başlayan 14 saatlik aydınlık ve gece saat 23:00'de başlayan 10 saatlik karanlık süresidir.

Larvaların aşırı yoğunlaşmasından kaçının. Genellikle tek bir Petri kabında 50 larvaldan fazlasını tutmayız. Döllenmeden beş gün sonra, larvalara geniş bir yüzme alanı sağlamak amacıyla zebra balıklarını 650 microliter kuyucuk boyutuna sahip 96 kuyucuklu plakaya aktarırız.

Plastik bir transfer pipeti kullanarak, her bir kuyucuğa nazikçe bir larva aktarın. Balıkları kuyucuklara aktardıktan sonra, su yüzeyi kuyucukların üst kısmıyla neredeyse sıfır olacak şekilde her kuyucuğu yeterince balık suyuyla doldurun. Kayıt kamerasında optik sorunlar oluşmasını önlemek için kuyucukları fazla veya eksik doldurmamaya dikkat edin.

Ayrıca kuyucuklara hava kabarcığı girmemesine dikkat edin. Balıklar artık ışık ve karanlığa verdikleri lokomotor tepkiler açısından izlenmeye hazırdır. Plakaya yerleştirilen zebra balıklarını kayıt cihazına götürelim.

Şimdi kayıt düzeneğini inceleyerek devam edelim. Balıkların bulunduğu 96 kuyucuklu plaka, buradaki beyaz tepsinin içindeki kayıt haznesine yerleştirilecek ve bir yay veya lastikle sabitlenecektir. Kamera, kutunun arka kısmına konumlandırılmıştır ve burada bulunan kutunun üstündeki aynalar kullanılarak plakaya odaklanmıştır.

Bu aynaların açısı, aynaları yerinde tutan vidalar çevrilerek ayarlanabilir. Kayıt odası, alttan kızılötesi LED'ler ile aydınlatılır. Bu sayede kamera, balıkları karanlıkta bile kaydedebilir.

Larvalar IR ışığı algılayamazlar, bu nedenle bu sabit IR aydınlatma deneyi etkilemez. Beyaz LED'ler kayıt odasını alttan aydınlatır. Birkaç saatten fazla süren deneyler için bunlar IR ışıklarından ayrı olarak kontrol edilirler.

Deney süresince sabit bir sıcaklığın korunmasına yardımcı olmak için hazne, yavaşça akan suyla doldurulabilir. Su, küçük bir akvaryum pompasıyla bir rezervuardan pompalanır ve tipik bir su altı akvaryum ısıtıcısı ile 28 °C'ye ısıtılır. Su, büyük bir tahliye deliğinden boşalır ve odadaki istenmeyen titreşimleri en aza indirmek için rezervuara geri döndürülür.

Tüm kayıt ünitesi ağır bir denge masasının üzerinde yer alır. Kayıt cihazı hazır olduğunda, hayvanları örtmek ve onları ışıktan daha fazla izole etmek için bir kutu kapağı kullanılır. Şimdi 96'nın hizalamasına geçelim.

Bunu gerçekleştirmek için önce, video takip yazılımının bilgisayar ızgarasıyla birlikte kuyucuklu plakayı, balıkları içeren 96 kuyucuklu plakayı kayıt haznesine yerleştirin. Uzun süreli deneyler için su banyosu kullanırken, su seviyesinin plakaya dökülmeden dengelenmesine izin vererek plakayı yavaşça suya yerleştirin. ViewPoint video takip yazılımında, tüm larvaların ve deneyin bilgisayar ekranında görünür olduğundan emin olun.

Yazılımın kontrollerini kullanarak, video takip yazılımının ızgarasını, her bir balık ızgaranın bir karesi içinde kalacak şekilde 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarıyla hizalayın. Bu adım, tüm kayıtlarınız için çok önemlidir. Takip bilgisayarı, her bir kutu için hareketi ayrı ayrı hesaplayacaktır.

Bu nedenle, bilgisayar ızgarasını yanlış hizalarsanız, balık hareketlerinin bir kısmı kaybolabilir veya daha da kötüsü, yan yana duran iki balık aynı alanı kaplayarak hizalamadan sonra tek bir balık olarak sayılabilir. Işıkların ne zaman yanıp söneceği bilgisayara programlanmıştır.

Kutuda genellikle üç saatlik daha hafif bir karanlık adaptasyon süresi tanırız. Bu, yalnızca bir bazal aktivite seviyesi elde etmekle kalmaz, aynı zamanda larvaların pipetleme ve taşıma işlemlerinin ardından sakinleşmelerine olanak sağlar. Ardından, kayıt odasının kapısını kapatır ve kayda başlarız.

Uygulamada, her bir balığın saniyelik aktivitesini kaydediyoruz, ancak viewpoint yazılımı aslında verileri kare kare kaydeder. Aşağıda ekran üzerinde, tek bir balığın gerçek zamanlı izlemini görebilirsiniz. Piksel hareketi açısından, beyaz çizgi piksel değişim sayısının belirlenmiş bir eşik değerinin altında olduğunu, yeşil çizgi ise piksel değişiminin eşik ayarının üzerinde olduğunu belirtir.

Eşik değeri, kısmen kullandığınız kameraya ve ışık düzeneğine bağlı olacaktır. Bizim düzeneğimizde, genellikle dört piksellik bir eşik değeri kullanıyoruz. Yani, dört pikselden daha azı değişiyorsa, bu durum arka plan olarak kabul edilir.

Dörtten fazla piksel hareket ediyorsa, bu durum balığın hareket ettiğini gösterir. Bu eşik değerinin, larval yüzme ve dönüş hareketlerinin neredeyse tamamını tespit ettiğini ampirik olarak belirledik. Kayıt kutuları larvaları oldukça iyi izole etse de, oda ışıklarını kapatıyoruz ve odadaki kapıların açılıp kapanması, dans partileri düzenlenmesi veya egzersiz rutinlerinin yapılması gibi mekanik gürültüyle oluşabilecek kesintileri en aza indirmeye özen gösteriyoruz.

Deney tamamlandıktan sonra, toplanan verileri bir Excel sayfasına veya tercih ettiğiniz analiz yazılımına aktarın. Verilerin görünümü şöyledir. Veriler, deneyin başlangıcından itibaren geçen zamanı ve saniyeleri ile her bir larvanın saniye başına aktivitesini içerir.

Burada, grafikteki oklarla belirtilen çeşitli açık ve kapalı yanıtlarla birlikte, tek bir larvanın deney süresince sergilediği aktiviteyi gösteren bir grafik yer almaktadır. Bu grafik, oklarla gösterilen çeşitli açık ve kapalı yanıtlarla birlikte, 40 balığın deney süresince sergilediği ortalama aktiviteyi göstermektedir. Görüleceği üzere, açık ve kapalı yanıtlar belirgin ve tutarlıdır.

Bu görsel motor yanıt deneyi mutant balıklar üzerinde de gerçekleştirilebilir. Bu çalışmalar için, optimal kontrol amaçları doğrultusunda, genellikle yabani tip balıkları ve mutant balıkları aynı plaka üzerinde dama tahtası düzeninde yerleştiririz. Mutant balıkları yabani tip balıklarla aynı plakada kullanırken, her bir kuyucuğa hangi tip balığın yerleştirildiğini not ettiğinizden emin olun.

Her birine yerleştirilen balıkların takibi için bir öneri şöyledir. İşte vahşi tip ve mutant larvaları karşılaştıran görsel motor yanıt sonuçları. Vahşi tip larvalarda yine belirgin ve tutarlı açma ve kapama yanıtları görüyoruz.

Buna karşın, göz gelişimi eksik olan chalk mutant larvaları, ışık artışlarına veya azalışlarına karşı aktivitelerini anlamlı düzeyde artırmamakta ve düşük bir bazal aktivite seviyesine sahiptirler. Bu sonuçlar, vahşi tip yanıtları ile NRC mutantları olarak da adlandırılan NO OKR mutantları ile karşılaştırmaktadır. OKR testi temel alındığında, NRC mutantının tamamen kör olduğu düşünülmüştü.

VMR testi kullanarak, NRC mutantının normal bir "kapalı" (off) yanıtına, ancak gecikmiş ve hantal bir "açık" (on) yanıtına sahip olduğunu kanıtlıyoruz. Bu nedenle, NRC mutantının daha önceden düşünüldüğü gibi tamamen kör olmadığı görülmektedir. Size zebrafish labate'nin ışık artışlarına ve azalışlarına karşı görsel motor yanıtını göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, balıkların geceye kıyasla gündüz saatlerinde daha aktif oldukları ve ışık şiddeti değişimlerine daha iyi tepki verdikleri için deneyin gün içerisinde yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.