Name: Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin görsel-motor yanıt testiyle Danio rerio larvalarının ışık değişimlerine davranışsal tepkilerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, görme yeteneklerini değerlendirmek için davranışsal nörobilim araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibeler EY0081 ve 5T32UY07145 Enstitüsü tarafından ve Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı tarafından desteklenmiştir. Jason Rihel Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Bristol-Squibb üyesidir.

Bu protokol, kendi laboratuvarı hafif artışlarla ve azaltır Zebra balığı larvalarının Görsel-Motor Yanıt gerçekleştirmek için gereken adımları özetliyor. Zebra balığı davranışsal çalışmalar için harika bir model sistem. Bakımı kolay, onlar büyük bir kavrama boyutları var ve bunlar hızla gelişir. Örneğin, gözleri Zebra balığı larvalarının gelişim 3 gün ve bir irkilme tepkisi gösterir ve bu süre ışığa duyarlı. Bölüm 1: 96 plaka bireysel balık Kaplama <ol><li> 28 yaşında bir aydınlık / karanlık döngüsü altında WT larvaları büyütün ° C kadar en az 4 gün fertilizasyon (dpf). Tipik ışık: karanlık döngüsü, 9:00 AM başlayan ve 10 saat ışıkları KAPALI, 11:00 başlayarak 14 saat ışıkları ON. Davranışsal en iyi sonuçlar için, aşırı kalabalık önlemek, genellikle tek bir petri en fazla 50 larva tutmak. </li><li> 4 dpf'e sonra, 96 plaka zebrafish aktarılacak hazırız. Larvaları daha yüzme oda vermek için, biz genellikle 96-plaka 650 ul büyük bir iyi boyutu ile kullanmak; Ancak, standart 96-kuyucuğu sadece iyi çalışır. Plastik bir transfer pipetlemeyin kullanarak, hafifçe ortalama bir larva transferi. </li><li> Kuyulara balık aktardıktan sonra her bir kuyu, kuyu üstüne su yüzeyinde neredeyse aynı hizada olduğu gibi yeterli balık su doldurun. Ya aşırı doldurmaktan ya da iyi underfilling kayıt kamera için optik sorunlara neden olabilir. Ayrıca, kuyuların içine kabarcıklar tanıtmak için özen gösterin. </li></ol> Bölüm 2: kayıt cihazları Anketi Protokolün bu kısmı için, lütfen filmi bileşenleri tanımlamak için başvurun ve kayıt cihazları kurmak daha yakından tanımak için. <ol><li> Kayıt odanın içinde 96-plaka konumlandırmak için iyi tanımlanmış bir yerdir. </li><li> Kamera arkasına yerleştirilmiş ve kutu kapalı aynalar kullanarak plaka üzerine odaklanmıştır. Yerde aynalar tutan vidaları çevirerek bu aynalar açısı ayarlanabilir. </li><li> Kayıt odasına kızılötesi LED alttan aydınlatılır. Bu kamera karanlıkta bile balık görmenizi sağlar. Larvaları kızılötesi ışık tespit edemez, bu sabit IR aydınlatma deney etkilemez. Beyaz LED'ler ayrıca aşağıdaki kayıt odasına aydınlatır. Kızılötesi ışıklar ayrı ayrı kontrol edilir. Yukarıda ya da yanlarda beyaz ışık ile donatıldı Aydınlatıcı kesinlikle mümkündür, ancak, bu durumda, bakım kamera ile etkileyebilir su yüzeyinden güçlü glares önlemek için alınması gerekir. </li><li> Birkaç saat daha uzun ömürlü, deneme süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korumaya yardımcı olmak için hafifçe akan su haznesi doldurmanız deneyler için. Sabit bir su akışı gerçekleştirmenin bir yolu, tipik bir sualtı akvaryumu ısıtıcı ile 28 ° 'ye kadar ısıtılan küçük bir akvaryum pompası bir rezervuar su pompası. </li><li> Oda sokak titreşimi en aza indirmek için, tüm kayıt ünitesi ağır bir denge tablo tepesine oturmak gerekir. </li></ol> Bölüm 3: 96-plaka, video izleme, bilgisayar ızgara ile uyumu Yazılım <ol><li> Kayıt odasına balık içeren 96-plaka koyun. </li><li> Bir su banyosu kullanırken, yavaş yavaş su seviyesi plaka üzerine dökülüp olmadan ayarlamak için bir şans vermek, su, tabak yerleştirin. Alternatif olarak, su akışı kapatmak plaka ekleyin ve sonra akışı devam. Ayrıca, 96 plaka yerinde tutmak için bir bahar ya da bir lastik bant kullandığınızdan emin olun. </li><li> Viewpoint Videotrack yazılımı denemenizi tüm larvaları bilgisayar ekranında görünür olup olmadığını kontrol edin. Yazılım kontrollerini kullanarak video izleme yazılımı, her balık ızgara bir kare içinde böyle plaka kuyuları ile ızgara hizalayın. Izleme bilgisayar, bilgisayar ızgara hizalarını bazı balık hareketleri kaybolmuş olabilir, bu kutuları her biri için ayrı ayrı hareket hesaplanırken olacaktır. Veya daha da kötüsü: bitişik iki balık aynı alanda yer alacak ve bir balık olarak sayılabilir. Bu adım, tüm kayıtlar için çok önemlidir. </li><li> Hizalama sonra, program, ışıklar açık ve kapalı gitmeli zamanlama. Genellikle 3 saat kutuya ışık veya karanlık adaptasyonu hem bazal aktivite düzeyi elde etmek için izin verir, ama aynı zamanda larvaları pipetleme ve taşıma sakinleştirmek için bir fırsat vermek. Temel sonra, biz o zaman 30 dakika 30 dakika KAPALI ışıkları takip ON ışıkları ile alternatif ve birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Daha sonra, kayıt odasının kapısını kapatın ve kaydetmeye başlayın. </li><li> Uygulamada (film bakın, biz, saniyede her bir balık aktivite kayıt, ancak aslında Açısından yazılım çerçeve çerçeve verileri kaydederveri toplama bir gösteri için). Kare başına en az piksel değiştirmek için eşik değeri ayarlama özel kamera ve ışık ayarları biraz bağlı olacaktır. Kurulum için, biz genellikle bir eşik 4 piksel kullanmak; az 4 piksel değişiyor, arka plan olarak kabul edilir,. Eğer 4'ten fazla piksel hareket ediyor, balık hareketli olduğunu gösterir. Biz ampirik bu kesim hemen hemen tüm larva yüzmek ve dönüş hareketleri algılar belirlenir. </li><li> Kayıt kutularını oldukça iyi olsa da, larvaları izole odada ışığı kapatın ve oda kapıları açma ve kapama, bir dans partisi olan, ya da egzersiz rutinleri gibi mekanik gürültü ile kesintileri en aza indirmek için dikkat. </li></ol> Bölüm 4: Veri Analiz <ol><li> Deney tamamlandıktan sonra, bir excel sayfasına veya favori analiz adasının içine toplanan veri aktarımı. </li><li> Ekli excel dosyasına veri ne gibi görünebilir bir örnektir: saniye içinde, tüm deney boyunca tüm balıklar için her saniyede larva deney ve faaliyetin başlangıç ​​zamanı (ek dosya Örnek Veri içerir Bu sayfanın Dosyalar bölümü). </li><li> Şekil 1. Tek bir larva faaliyet gösteren bir örnek gösterir. Şekil 2, 40 WT Zebra balığı larvalarının ortalama temsil eden bir eser. ON ve OFF yanıtları ortalama belirgin ve tutarlı. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Şekil 1" width="569" height="398"> Şekil 1: tek bir balık Aktivitesi faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt olarak, tek bir dpf'e 5 WT balık . ON yanıtlar, siyah oklar ve kırmızı oklarla OFF yanıtları ile gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Şekil 2" width="577" height="387"> Şekil 2: 40 balık ortalama faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt 5 dpf'e az 40 WT balık ortalama aktivite. ON ortalama (siyah ok) ve OFF (kırmızı oklar) yanıtları belirgin ve tutarlı. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 3, tüm deneylerin kullanılan deneysel anahat şematik bir anahat. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Şekil 3" width="530" height="479"> Şekil 3. Görsel Motor Tepkisi (VMR) testi Deneysel tasarım A) Bireysel balık bir kayıt odasına 96-plaka yerleştirilir. Her balık faaliyet saniyede ölçülür. B) Balık, bunları halletmek için de bir temel aktivite düzeyi elde etmek için koyu veya açık uyum bir süre verilir. 3 saat olmak üzere toplam 30 dakika İLİŞKİN ışıkları ve ışıkların Sürelerinin OFF ardışık olarak tanıtılmaktadır. Bu şema Prober ark adapte oldu, 2006. Görsel-Motor Yanıt grafikleri neye benziyor? Biz ışık artırır ve azaltır WT balık ON ve OFF tepkiler ölçülür. Bu tepkiler göz fonksiyonu bağlı olduğunu onaylamak için, biz herhangi bir gözleri geliştirmek chk mutantlar aktivitesini ölçtük . Şekil 4 WT hayvanların yanı sıra chk mutantlar elde edilen ortalama faaliyet göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Şekil 4" width="489" height="212"> Şekil 4: WT balık lateral gözler aracılı yanıtları ON ve OFF açık var, 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı yanıt 5 dpf'e Zebra balığı larvalarının lokomotor davranış saniyede kaydedilir . Her eser, 120 bireysel WT (mavi trace) veya chk mutant larvaları (turuncu iz) 3 deney içinde kaydedilen 480 yanıtların ortalama temsil eder . Chk mutantlar ışık artırır veya azaltır ya da önemli ölçüde faaliyetlerini artırmak ve aktivitesi düşük bir temel seviyesine sahip değilsiniz . Bu rakam, Emran ve ark, 2007 uyarlanmıştır. NRC mutant balık Görsel-Motor Yanıtları. NRC mutant okr testi dayalı tamamen kör olduğu düşünülüyordu. NRC mutant, fotoreseptör terminalleri düzgün formu değil ve ciddi görme yolarının 1 tehlikeye. Bu mutant balık retina ganglion hücre kayıtları, bunlar ağırlıklı olarak OFF-tipi ganglion hücre tepkiler, bazı anormal ON-OFF, ancak 2-tipi yanıtları saf sergilediği saptandı. VMR testi kullanılarak NRC mutant normal bir OFF-yanıt ve geç ve cansız ON-yanıt olduğunu göstermiştir (see Şekil 5). Böylece, NRC mutant daha önce 2 düşündüğü gibi tamamen kör değildir. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Şekil 5" width="591" height="244"> Şekil 5: NRC mutats ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt olarak etkinliği artırmak Davranışsal tepkiler WT ve NRC mutant 5 dpf larvaları ışık ON ve OFF. Her bir eser, her genotip 120 bireysel balık 480 yanıtların ortalama temsil eder. NRC mutantlar ortalama lokomotor davranış (pembe izleri) biraz WT balık (mavi izlerini) ile karşılaştırıldığında azalır ama uyaran KAPALI ışığında aşağıdaki dinç kalır. ON ON WT balık tepki ışığa göre ışık NRC mutant yanıt yavaş yükselme zamanı unutmayın .

<ol><li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li>
<li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li>
<li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin%2Forexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
</ol>

Film gösteren deneysel prosedürleri WT balık bütün temsilcisi. Ancak, bu deneyler de mutant balık (temsili bir sonuç bölümüne bakınız) analog olarak yapılabilir. Biz optimal kontrol amaçlı bir denetimi kurulu anahat aynı plaka plaka WT balık ve mutant balık öneririz. WT balık aynı plaka üzerinde mutant balık, balık türü, her bir kuyunun kaplama ne yazmak emin olun. Burada her iyi kaplama balık (veri levha ile not defteri göster) takip etmek için nasıl bir öneri. Ayrıca, bu günün aynı zamanda belli bir deneyi tekrarlar yapmak...

<table><tbody><tr><td>Mikroplaka cihazları</td><td>Araç</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7701-1651</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Araç</td><td>VWR international</td><td>202205</td><td></td></tr><tr><td>Balık suyu</td><td>Reaktif</td><td></td><td></td><td>referans #4'e bakınız</td></tr><tr><td>Kayıt odaları (Zebrabox)</td><td>Araç</td><td>Viewpoint Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videotrack Yazılımı</td><td>Araç</td><td>Viewpoint Lifesciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

işık parlaklıkları değişiklikler zebra balığı, duyarlılık tedbir davranış testi

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Optokinetik refleks (okr) temel bir görme refleksi en omurgalılar tarafından sergilenen ve görsel sahne göreceli göz istikrara önemli bir rol oynar. Ancak okr, bir hayvan hareketli çizgiler tespit gerektirir ve bir okr sergi için başarısız balık tamamen kör olmayabilir mümkündür. Bir zebrafish mutant, hiçbir optokinetik yanıt c (NRC), herhangi bir ışık koşulları altında test edilmiş ve tamamen kör olduğu bildirildi hiçbir okr vardır. Daha önce, bu mutant OFF-ganglion hücre aktivitesi kaydedilebilir olduğunu göstermiştir. NRC mutant olarak hiçbir okr mutant balık, basit ışık artışlarla ve görsel motor davranış assay (VMR) geliştirdi azaltır tespit olup olmadığını belirlemek için. Bu testte, tek Zebra balığı larvaları otomatik bir video izleme sistemi kullanılarak larvaların eş zamanlı izleme sağlayan bir 96 plaka her kuyuda yerleştirilir. 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı her larva lokomotor yanıtları kaydedildi ve ölçüldü. WT balık, irkilme tepkisi olarak bilinen, alt daha bazal aktivite dönüşü takip ON ışıklar, motor aktivite kısa bir başak üzerine bir dondurma olarak adlandırılan. WT balık (birkaç dakika içinde) başlangıç ​​lokomotor aktivite dönmek de keskin ışıklar kapalı aşağıdaki hemen lokomotor aktivite artışı ve ancak yavaş yavaş. NRC mutantlar WT balık gibi KAPALI ışığa benzer bir tepki, ama WT balık ile karşılaştırıldığında ortalama aktivite hafif bir azalma gösterebilir. NRC mutantlar ON ışığa tepki olarak motor aktivitede gecikmiş ve halsiz. NRC mutant yanıt yanıt ON WT ışık lambası yavaş bir yükselme zamanı vardır. NRC balık tamamen kör olduğunu işaret etmektedir. Teleosts olmayan retina dokuları ışık tespit Çünkü, biz ışık yoğunluğu değişiklikleri hemen davranışsal tepkilerin tamamen gelişiminin erken evrelerinde gözleri eksikliği chokh (chk) mutantlar kullanarak sağlam göz gerektirir doğruladı. Bizim VMR tayininde, chk mutantlar lateral gözler, bu davranışı aracılık gösteren ya ON ışık ya da KAPALI hiçbir irkilme tepkisi gösterir. VMR testi burada ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt Zebra balığı larvalarının yeteneğini test değildir köklü okr tahlil tamamlar nitelendirdi. Ayrıca, VMR testinin otomasyon ışık şiddeti tahrik görsel tepkiler kusurları için yüksek verimlilik tarama kendisini katıyor.

Görsel-Motor Yanıt hafif artışlarla ve azaltır yanıt larva zebrafish motor çıkışını ölçmek için geliştirdi. Biz de dahil olmak üzere başka bir görme testi optokinetik refleks tarafından test edildiğinde tamamen kör olduğu düşünülüyordu optokinetik yanıt (NRC) mutantlar, hiçbir zebrafish vizyon mutant inceledi.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

Optokinetik refleks (OKR), çoğu omurgalı tarafından sergilenen temel bir görsel reflekstir ve gözün ...'ye göre stabilize edilmesinde önemli bir rol oynar.

Dowling laboratuvarında, hareketleri algılayamayan zebra balığı mutantlarının ışığı algılayıp algılayamadığını ve kör olup olmadıklarını belirlemek amacıyla zebra balıklarının retinasının fizyolojisini ve gelişimini inceliyoruz. Bunu yapmak için görsel motor yanıtlarını (VMR) test ediyoruz. Zebra balıklarını döllenmeden yaklaşık dört gün sonra topluyoruz.Bunları 96 kuyucuklu plakalara yerleştirin, uygun bir görüntüleme düzeneği hazırlayın, video takip yazılımını plaka ile hizalayın ve ardından ışıktan karanlığa veya karanlıktan ışığa geçişler sonrası balıkların motor yanıtını takip edin; biz buna VMR diyoruz. Merhaba, ben Harvard Üniversitesi'ndeki John Dowling laboratuvarından ve Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Farida Imran.Ben Jason Rio. Harvard Üniversitesi'ndeki moleküler ve hücresel biyoloji bölümünde, Alexander Shear'ın laboratuvarındayım. Bugün size, ışık artışlarına ve azalışlarına karşı zebrafishlerdeki görsel motor yanıtı göstereceğiz.Haydi başlayalım. Görsel motor yanıt deneyi ile başlamak için öncelikle, vahşi tip zebrafish larvalarını, döllenmeden sonraki en az dördüncü güne kadar 28 °C'de, karanlık-aydınlık döngüsü altında büyütün. En iyi davranışsal sonuçlar için tipik ışık-karanlık döngümüz, sabah saat 09:00'da başlayan 14 saatlik aydınlık ve gece saat 23:00'de başlayan 10 saatlik karanlık süresidir.Larvaların aşırı yoğunlaşmasından kaçının. Genellikle tek bir Petri kabında 50 larvaldan fazlasını tutmayız. Döllenmeden beş gün sonra, larvalara geniş bir yüzme alanı sağlamak amacıyla zebra balıklarını 650 microliter kuyucuk boyutuna sahip 96 kuyucuklu plakaya aktarırız.Plastik bir transfer pipeti kullanarak, her bir kuyucuğa nazikçe bir larva aktarın. Balıkları kuyucuklara aktardıktan sonra, su yüzeyi kuyucukların üst kısmıyla neredeyse sıfır olacak şekilde her kuyucuğu yeterince balık suyuyla doldurun. Kayıt kamerasında optik sorunlar oluşmasını önlemek için kuyucukları fazla veya eksik doldurmamaya dikkat edin.Ayrıca kuyucuklara hava kabarcığı girmemesine dikkat edin. Balıklar artık ışık ve karanlığa verdikleri lokomotor tepkiler açısından izlenmeye hazırdır. Plakaya yerleştirilen zebra balıklarını kayıt cihazına götürelim.Şimdi kayıt düzeneğini inceleyerek devam edelim. Balıkların bulunduğu 96 kuyucuklu plaka, buradaki beyaz tepsinin içindeki kayıt haznesine yerleştirilecek ve bir yay veya lastikle sabitlenecektir. Kamera, kutunun arka kısmına konumlandırılmıştır ve burada bulunan kutunun üstündeki aynalar kullanılarak plakaya odaklanmıştır.Bu aynaların açısı, aynaları yerinde tutan vidalar çevrilerek ayarlanabilir. Kayıt odası, alttan kızılötesi LED'ler ile aydınlatılır. Bu sayede kamera, balıkları karanlıkta bile kaydedebilir.Larvalar IR ışığı algılayamazlar, bu nedenle bu sabit IR aydınlatma deneyi etkilemez. Beyaz LED'ler kayıt odasını alttan aydınlatır. Birkaç saatten fazla süren deneyler için bunlar IR ışıklarından ayrı olarak kontrol edilirler.Deney süresince sabit bir sıcaklığın korunmasına yardımcı olmak için hazne, yavaşça akan suyla doldurulabilir. Su, küçük bir akvaryum pompasıyla bir rezervuardan pompalanır ve tipik bir su altı akvaryum ısıtıcısı ile 28 °C'ye ısıtılır. Su, büyük bir tahliye deliğinden boşalır ve odadaki istenmeyen titreşimleri en aza indirmek için rezervuara geri döndürülür.Tüm kayıt ünitesi ağır bir denge masasının üzerinde yer alır. Kayıt cihazı hazır olduğunda, hayvanları örtmek ve onları ışıktan daha fazla izole etmek için bir kutu kapağı kullanılır. Şimdi 96'nın hizalamasına geçelim.Bunu gerçekleştirmek için önce, video takip yazılımının bilgisayar ızgarasıyla birlikte kuyucuklu plakayı, balıkları içeren 96 kuyucuklu plakayı kayıt haznesine yerleştirin. Uzun süreli deneyler için su banyosu kullanırken, su seviyesinin plakaya dökülmeden dengelenmesine izin vererek plakayı yavaşça suya yerleştirin. ViewPoint video takip yazılımında, tüm larvaların ve deneyin bilgisayar ekranında görünür olduğundan emin olun.Yazılımın kontrollerini kullanarak, video takip yazılımının ızgarasını, her bir balık ızgaranın bir karesi içinde kalacak şekilde 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarıyla hizalayın. Bu adım, tüm kayıtlarınız için çok önemlidir. Takip bilgisayarı, her bir kutu için hareketi ayrı ayrı hesaplayacaktır.Bu nedenle, bilgisayar ızgarasını yanlış hizalarsanız, balık hareketlerinin bir kısmı kaybolabilir veya daha da kötüsü, yan yana duran iki balık aynı alanı kaplayarak hizalamadan sonra tek bir balık olarak sayılabilir. Işıkların ne zaman yanıp söneceği bilgisayara programlanmıştır.Kutuda genellikle üç saatlik daha hafif bir karanlık adaptasyon süresi tanırız. Bu, yalnızca bir bazal aktivite seviyesi elde etmekle kalmaz, aynı zamanda larvaların pipetleme ve taşıma işlemlerinin ardından sakinleşmelerine olanak sağlar. Ardından, kayıt odasının kapısını kapatır ve kayda başlarız.Uygulamada, her bir balığın saniyelik aktivitesini kaydediyoruz, ancak viewpoint yazılımı aslında verileri kare kare kaydeder. Aşağıda ekran üzerinde, tek bir balığın gerçek zamanlı izlemini görebilirsiniz. Piksel hareketi açısından, beyaz çizgi piksel değişim sayısının belirlenmiş bir eşik değerinin altında olduğunu, yeşil çizgi ise piksel değişiminin eşik ayarının üzerinde olduğunu belirtir.Eşik değeri, kısmen kullandığınız kameraya ve ışık düzeneğine bağlı olacaktır. Bizim düzeneğimizde, genellikle dört piksellik bir eşik değeri kullanıyoruz. Yani, dört pikselden daha azı değişiyorsa, bu durum arka plan olarak kabul edilir.Dörtten fazla piksel hareket ediyorsa, bu durum balığın hareket ettiğini gösterir. Bu eşik değerinin, larval yüzme ve dönüş hareketlerinin neredeyse tamamını tespit ettiğini ampirik olarak belirledik. Kayıt kutuları larvaları oldukça iyi izole etse de, oda ışıklarını kapatıyoruz ve odadaki kapıların açılıp kapanması, dans partileri düzenlenmesi veya egzersiz rutinlerinin yapılması gibi mekanik gürültüyle oluşabilecek kesintileri en aza indirmeye özen gösteriyoruz.Deney tamamlandıktan sonra, toplanan verileri bir Excel sayfasına veya tercih ettiğiniz analiz yazılımına aktarın. Verilerin görünümü şöyledir. Veriler, deneyin başlangıcından itibaren geçen zamanı ve saniyeleri ile her bir larvanın saniye başına aktivitesini içerir.Burada, grafikteki oklarla belirtilen çeşitli açık ve kapalı yanıtlarla birlikte, tek bir larvanın deney süresince sergilediği aktiviteyi gösteren bir grafik yer almaktadır. Bu grafik, oklarla gösterilen çeşitli açık ve kapalı yanıtlarla birlikte, 40 balığın deney süresince sergilediği ortalama aktiviteyi göstermektedir. Görüleceği üzere, açık ve kapalı yanıtlar belirgin ve tutarlıdır.Bu görsel motor yanıt deneyi mutant balıklar üzerinde de gerçekleştirilebilir. Bu çalışmalar için, optimal kontrol amaçları doğrultusunda, genellikle yabani tip balıkları ve mutant balıkları aynı plaka üzerinde dama tahtası düzeninde yerleştiririz. Mutant balıkları yabani tip balıklarla aynı plakada kullanırken, her bir kuyucuğa hangi tip balığın yerleştirildiğini not ettiğinizden emin olun.Her birine yerleştirilen balıkların takibi için bir öneri şöyledir. İşte vahşi tip ve mutant larvaları karşılaştıran görsel motor yanıt sonuçları. Vahşi tip larvalarda yine belirgin ve tutarlı açma ve kapama yanıtları görüyoruz.Buna karşın, göz gelişimi eksik olan chalk mutant larvaları, ışık artışlarına veya azalışlarına karşı aktivitelerini anlamlı düzeyde artırmamakta ve düşük bir bazal aktivite seviyesine sahiptirler. Bu sonuçlar, vahşi tip yanıtları ile NRC mutantları olarak da adlandırılan NO OKR mutantları ile karşılaştırmaktadır. OKR testi temel alındığında, NRC mutantının tamamen kör olduğu düşünülmüştü.VMR testi kullanarak, NRC mutantının normal bir "kapalı" (off) yanıtına, ancak gecikmiş ve hantal bir "açık" (on) yanıtına sahip olduğunu kanıtlıyoruz. Bu nedenle, NRC mutantının daha önceden düşünüldüğü gibi tamamen kör olmadığı görülmektedir. Size zebrafish labate'nin ışık artışlarına ve azalışlarına karşı görsel motor yanıtını göstermiş olduk.Bu prosedür uygulanırken, balıkların geceye kıyasla gündüz saatlerinde daha aktif oldukları ve ışık şiddeti değişimlerine daha iyi tepki verdikleri için deneyin gün içerisinde yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, otomatik bir izleme yazılımı kullanılarak zebra balığı ve şişman başlı minnow larvalarının fotomotor yanıt testi açıklanmaktadır. Protokol, aydınlatma durumundaki ani bir değişikliğin ardından larva balığının davranışsal tepkisini ölçer.

Fotomotor Tepki Testi: Larva Zebra Balığının Aydınlatma Durumundaki Ani Bir Değişikliğe Davranışsal Tepkisini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Video, etanole maruz kaldıktan sonra zebra balıklarında anksiyete ile ilgili davranışı incelemek için aydınlık-koyu tercih testini açıklamaktadır.

Aydınlık-Koyu Tercih Testi: Zebra Balıklarında Kaygı ile İlgili Davranışları İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda zebra balıklarında optokinetik tepki testi açıklanmaktadır. Video, görsel hareketli uyarana dayalı olarak refleksif göz hareketlerini ölçer ve zebra balıklarında görme keskinliğini belirler.

Optokinetik Yanıt Testi: Zebra Balıklarında Görme Keskinliğini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Video, zebra balığı larvalarının kaçınma ve timotaksis testini anlatıyor. Video, zebra balığı larvalarının görsel caydırıcı uyarana yanıt olarak davranışlarını inceler.

Zebra Balığı Kaçınma ve Timotaksis Deneyi: Caydırıcı Görsel Uyarana Yanıt Olarak Larva Davranışını İncelemek İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Balıkları ilaçlara maruz bırakırken değişkenliği azaltmak için yeni bir yöntem açıklanmıştır.  Çeşitli etanol maruziyeti modellerine maruz kalan balıkların, açık / koyu skotaktakik bir testte geri çekilme sırasında anksiyete seviyelerinin değiştiği bulundu.

Çoklu Zebra balığı için İlaç İdaresi Bir Roman Yöntemi ( Danio rerio) Ve Çekilme Niceleme

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Burada, larva zebra balığı ve koca kafa minnow lokomotor aktivite ve bir otomatik izleme yazılımı kullanarak photomotor yanıt (PMR) incelemek için bir protokol mevcut. Ortak toksikoloji biyoanalizler dahil, bu davranışların analizleri kimyasal bioactivity incelemek için bir tanı aracı sağlarlar. Bu iletişim kuralı kafein, modeli neurostimulant kullanılarak açıklanmıştır.

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Bu yazıda yetişkin zebrafish stres davranışsal ölçmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım, stresli bir durumda, zebra balığı bir tankın alt yarısını tercih ettiği doğuştan gelen eğilimin avantajlarından yararlanır. Biz de Farmakoloji ile tahlil bağlantı için yöntemleri tarif.

Zebrafish içinde doğuştan stres eğitimi için davranışsal yaklaşımlar

Bu protokol, MPTP ile tedavi edilen zebrafish larvalarında Parkinson hastalığına benzeyen motor ve motor dışı eksiklikleri değerlendirmek için davranışsal fenotipleme paradigması oluşturur.

Davranışsal Deneye Dayalı Zebrafish Larvalarında MPTP Kaynaklı Parkinson Benzeri Davranışsal Fenotiplerin Fenotipik Profillenmesi

Öğrenin görsel-motor yanıt testiyle Danio rerio larvalarının ışık değişimlerine davranışsal tepkilerini nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, görme yeteneklerini değerlendirmek için davranışsal nörobilim araştırmalarında kullanılır.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

Daha fazla video keşfet