Name: Metillenmiş DNA Immunoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Öğrenin, metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) protokolünü kullanarak epigenetik araştırmalarda metillenmiş DNA fragmanlarını nasıl izole edeceğinizi. Bu yöntem, kanser ve gelişim biyolojisi çalışmalarında DNA metilasyon desenlerini incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, bu video ve makale eleştirmeyi katılımları için Brown ve Lam laboratuvarları üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Michael Smith Sağlık Araştırma Vakfı Enstitüsü&#39;nün fonları tarafından desteklenmiştir.

DNA EKSTRAKSİYON VE ÖRNEK HAZIRLAMA Farklı örnekleri çeşitli DNA (kültür hücreleri, taze yanı formalin ile fikse parafine gömülü dokularda dondurulmuş) MeDIP için kullanılabilir. Yüksek derecede saflaştırılmış DNA, histon gibi ilişkili proteinlerin olmadan kullanmak önemlidir. DNA kantitatif ve antikor bağlanma ile müdahale örnek olarak, mümkün olduğunca çok RNA kaldırmak için de önemlidir. MeDIP için kullanılan DNA miktar 200 ng kullanılabilir DNA miktarına bağlı olarak 1 mg arasında olabilir. Bu protokol göstermek için, 1 mg DNA kullanılır. Aşağıdaki protokol kültürlü hücreler yüksek kaliteli çift iplikli DNA sağlayacaktır. Diğer protokoller, diğer örnek türlerinin DNA ekstraksiyonu için istihdam edilmelidir. <ol><li> 1.7 ml Eppendorf tüp bir hücre pelet sindirim tampon 400 ul ekleyin. </li><li> Tüp proteinaz K 100 mikrogram ve 50 gece inkübe ° C </li><li> 500 ul fenol pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin. </li><li> Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın. </li><li> Tekrar bir kez 3 ile 5 arasındaki adımları. </li><li> 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin. </li><li> Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın. </li><li> RNaz A 40 mikrogram ekleyin ve 37 az 1 saat inkübe ° C. </li><li> 500 ul fenol pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin. </li><li> Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın. </li><li> Tekrar bir kez, 13 üzerinden 11 Adımlar. </li><li> 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin. </li><li> Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın. </li><li> 1/10th hacim 3 M sodyum asetat (40 ul) ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> % 100 etanol 2 cilt (900 ul) -20 ° C&#39;de, 20 dakika boyunca iyice karıştırın ve yer. </li><li> 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C </li><li> , Etanol çıkarın darbe spin ve artık etanol çıkarın. </li><li> Yıkamak için 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C </li><li> % 70 etanol çıkarın darbe spin ve pipetleme kalan etanol kaldırmak. </li><li> Hava pelet kalan etanol tüm izlerini silmek için oda sıcaklığında 10 dakika açık kapak ile kurulayın. </li><li> 4 gecede sterilize dH2O 50 ul yeniden süspanse DNA ° C </li><li> NanoDrop Spektrofotometre ile DNA kantitatif olarak tanımlanmaktadır. A 260: 1.8 280 oranı idealdir. </li><li> 100 baz puan (bp) merdiven ile bir agaroz jel üzerinde DNA kalitesi ve boyut aralığı belirleyin. SYBR Altın gibi DNA az miktarda son derece duyarlı bir boya ile boyanarak az 10 ng genomik DNA,% 1.7 agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir. </li><li> Başına bir örnek silikonlu tüp, steril dH 2 O hacmi kalan 50 ul toplam hacmi 1 mg DNA hazırlamak </li></ol> DNA Sonikasyon DNA sonication ve MeDIP protokol tüp duvarları olmayan belirli bağlayıcı proteinlerin önlemek için siliconzied tüpler yapılmalıdır. DNA örnekleri için en uygun sonication kez jel elektroforezi (Adım 27) belirlenen DNA örneği parçalanma derecesine dayanır. Örneğin, kültürlü hücrelerinden çıkarılan DNA, çok yüksek molekül ağırlığı olmalı ve daha sonra genellikle kısmen bozulmuş arşiv örneklerden çıkarılan DNA daha fazla sonication gerekecektir. Örnekleri düzgün yüksek molekül ağırlığı varsa, tek tek her bir numune kontrol etmeden bu protokolü olarak açıklanan sonication ile devam etmek için bu noktada mantıklı. Örnekleri arşiv örnekleri ile parçalanmış iseniz, 300 100bp parçaları elde etmek için sonication kez azaltarak muhtemel sonication prosedürü uyum için gerekli olacaktır. Kısmen bozulmuş, sonication parametreleri optimizasyonu ilgi temsil eden bir örneklem üzerinde yapılan numunelerde süreci bekliyoruz. Jel elektroforezi (Adım 27) gözlenen DNA parçalanma derecesine göre, deneyci örnek için en uygun sonication zaman önceden hesaplamak. Burada yüksek molekül ağırlıklı DNA kullanılarak otomatik bir sonicating cihazı (Diagenode gelen Bioruptor, UCD-200 TM) ile sonication 300-1000 bp DNA parçalarının elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. <ol><li> Biorupter içinde su, 4 ° C olması gerekir </li><li> Otomatik ayarları 7 dakika (30 sn 30 sn maksimum güç kapalı) sonikasyon. </li><li> Silikonlu 1.7 ml santrifüj tüpüne immunoprecipitation (IP) reaksiyonu için sonicated ürün ve yeri (40 ul) 800 ng çıkarın. </li><li> Girdi olarak hizmet kalan 200 ng (10 ul) () (4 mağaza ° C) referans DNA kenara koyun. </li&gt; </ol> Metillenmiş DNA OF IMMUNOPRECIPITATON <ol><li> 95 ° C&#39;de su banyosunda 10 dakika süreyle IP reaksiyonu (800 ng) için kullanılacak olan DNA denatüre. </li><li> Hemen buz üzerinde soğutun. Sonraki adıma geçmeden önce (yaklaşık 5 dakika buz üzerinde) tamamen DNA soğumasını bekleyin. </li><li> 5 mikrogram monoklonal antikor ekleyin. </li><li> IP tampon (Bu protokol boyunca oda sıcaklığında) 500 ul nihai hacmi ekleyin. </li><li> Tüp tutucu dönen 2 saat 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5. adımı tamamlandıktan hemen önce, yıkama (Adımlar 6-11) Dynabeads hazırlar. Öncelikle, iyice karıştırın tarafından flakon boncuk tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yeni silikonlu bir tüp içine (örneğin, 8 reaksiyon yaparsa, 9, yani 270 ul için yeterli boncuk kaldırmak), 30 ul reaksiyon başına yeniden süspanse Dynabeads artı 1 (~ 2 x 10 7) aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika manyetik raf tüp yerleştirin. </li><li> Süpernatantı Pipet. Süpernatant çıkarırken, pipet ucu ile iç duvar (mıknatıs boncuk çekmek) karşı boncuk dokunmaktan kaçının. </li><li> Mıknatıs tüp çıkarın, boncuklar ve IP tampon aşırı miktarda (750-1000 ul ul) tekrar süspansiyon haline getirin. Oda sıcaklığında 2 dakika geri manyetik raf tüp yerleştirin. </li><li> Yıkama bir kez daha tekrarlayın ve sonra Adım 7 kaldırıldı orijinal hacminin IP tampon yıkanmış boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Her IP reaksiyon yıkanmış Dynabeads 30 ul ekle </li><li> 2 saat için dönen bir tüp tutucu inkübe 4 ° C </li><li> Inkübasyon tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığında 2 dakika manyetik rafa yerleştirilir. </li><li> Süpernatantı Pipet. Pipet ucu ile tüpün iç duvarına (mıknatıs boncuk çekmek) dokunmaktan kaçının. IP tampon 500 ul ekleyin. Tüp içindekileri karıştırın ve 2 dakika için manyetik rafa geri koymak. 500 ul IP tampon bir kez yıkayın tekrarlayın. </li><li> Son yıkama süpernatantı çıkardıktan sonra, sindirim tampon 400 ul boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Proteinaz K 100 mikrogram ile reaksiyon davranın ve 50 gece inkübe ° C </li></ol> IMMUNOPRECIPITATED DNA SAFLAŞTIRMA <ol><li> 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ve iyice vorteks ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin. </li><li> Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın. </li><li> Sulu ve organik katmanları arasında interfaz bulutlu görünürse, 1 ile 3 arasındaki adımları tekrarlayın. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat (40 ul) ve vorteks ekleyin. </li><li> 1 glikojen ul (20 mg / ml) ve vorteks ekleyin. </li><li> % 100 etanol, girdap ve -20 ° C&#39;de 20 dakika yerine 2 cilt (1000 ul) ekleyin. </li><li> 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C </li><li> , Etanol çıkarın darbe spin ve artık etanol çıkarın. </li><li> Yıkamak için 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. 4. 20 dakika boyunca 13 000 g Vortex kısaca, ve spin ° C </li><li> % 70 etanol çıkarın darbe spin ve pipetleme kalan etanol kaldırmak. </li><li> Hava pelet kalan etanol tüm izlerini silmek için oda sıcaklığında 10 dakika açık kapak ile kurulayın. </li><li> 10 ul yeniden süspanse DNA pelet dH 2 0 sterilize edilmelidir. </li></ol> PCR ile doğrulama <ol><li> MeDIP prosedürü kullanarak, normal bir insan DNA (erkek veya kadın) MeDIP protokol yaparak çalışma, metilasyon için zenginleştirilmiş olarak bilinen bir bölge ve daha sonra assaying olduğundan emin olmak için test edebilir. </li><li> PCR tüp MeDIP ürünün% 30, ve başka bir PCR tüpüne, MeDIP ürünün başka bir% 30 çıkarın. </li><li> DNA&#39;nın PCR tüp içine 10 ng ve 10 ng DNA&#39;nın başka bir PCR tüpünün içine koyun. Artık dört ayrı PCR reaksiyonları kurmak olmalıdır. </li><li> Tablo 1&#39;de belirtildiği gibi PCR H19 ve CTRL primerleri kullanarak gerçekleştirin. </li><li> Tablo 2&#39;de belirtildiği gibi 12.5 ul toplam hacmi ile PCR reaksiyonlar için iki mastermixes (her astar kümesi için biri) hazırlayın. </li><li> Thermocycle PCR Tablo 3&#39;te belirtilen şartlara. </li><li> PCR ürünlerinin görünüm için% 2&#39;lik agaroz jel üzerinde 5 ul çalıştırın. </li><li> Başarılı MeDIP için beklenen sonuçlar Tablo 4&#39;te gösterilmiştir. </li></ol> Tablolar Tablo 1: H19 ve PCR doğrulama için CTRL primerleri. <table border="1"><tbody><tr><td> Astar Seti </td><td> İleri Astar </td><td> Ters Astar </td><td> Beklenen Ürün Boyutu </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (kontrol) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tablo 2. PCR reaksiyonları için Mastermixes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (kişi başına RXN) </td><td> CTRL Mix (kişi başına RXN) </td></tr><tr><td&gt; GKD 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> 10X Tampon </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP karışımı (her biri 10 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Astarlar (H19_F / R veya CTRL_F / R) (10 mcM her F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. PCR thermocyling. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Beklenen başarılı MeDIP PCR sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> DNA </td></tr><tr><td> Primer kullanılan </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Olumlu </td><td> Olumlu </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Olumlu </td><td> Negatif </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Hastalığında önemli rol DNA metilasyon oynar büyüyen bir farkındalık vardır, bu nedenle testlerin geliştirilmesi, bu değişikliği ölçmek için 13, 12, 3 giderek daha önemli hale gelmektedir. MeDIP teknik tüm genomu ve lokus spesifik seviyesi 6, 7, tarama için bir mükellef araçtır . Bu teknik, DNA başlayan sınırlı miktarda kullanarak DNA metilasyon seviyelerini hızlı bir görünüm sağlar ve farklı kaynaklardan arasında kolay karşılaştırma için sağlar. MeDIP ürün kullanarak Downstream uygulamalar tüm gen...

<table><tbody><tr><td>Biorupter sonikatör</td><td>Araç</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml SafeSeal Mikro santrifüj Tüpleri</td><td>Diğer</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 Spektrofotometre</td><td>Araç</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Birincil Antikor: Anti-5&amp;rsquo;-metilsitozin fare mAb</td><td>Reaktif</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>İkincil Antikor: Dynabeads M-280 Koyun anti-fare IgG</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Tüp Rafı</td><td>Araç</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Araç</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Oda sıcaklığında saklanır</td></tr><tr><td>Digesyon Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

metillenmiş dna immunoprecipitation

Methylated DNA Immunoprecipitation

DNA metilasyon paternlerinin belirlenmesi epigenetik çalışma metilasyon gen ekspresyonu üzerinde önemli etkileri olduğu bilindiği gibi, ortak bir prosedür ve hastalığın yanı sıra normal gelişimi ile ilgili<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Böylece, metil DNA ve non-metil DNA arasında ayrım yapma yeteneği, bu tür çalışmalar için metilasyon profilleri üreten için gerekli. Metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) ilgi bir örnek metillenmiş DNA çıkarılması için etkin bir tekniktir<sup&gt; 5-7</sup&gt;. DNA az 200 ng örnek bir antikor ya da immunoprecipitation (IP), reaksiyon için yeterli. DNA boyutu 300-1000 bp arasında değişen parçaları içine sonicated ve immunoprecipitated (IP) ve giriş (IN) kısımları ayrılır. IP DNA daha sonra, monoklonal antikor metillenmiş DNA bağlamak için izin denatüre ve sonra anti-5&#39;mC inkübe ısı. Bundan sonra, primer antikor afinite ile ikincil bir antikor içeren manyetik boncuk eklenir ve inkübe edilir. Bu boncuk bağlanan antikorlar, ilk adımda kullanılan monoklonal antikor bağlanacaktır. Antikor kompleksi (metil DNA) bağlı DNA çözüm kompleksleri dışarı çekmek için bir mıknatıs kullanarak DNA geri kalanından ayrılır. IP tampon kullanarak birçok yıkar sonra ilişkisiz, non-metil DNA kaldırmak için yapılır. Metillenmiş DNA / antikor komplekslerini sonra sadece metillenmiş DNA zedelemeden antikorlar sindirmek için Proteinaz K ile sindirilir. Protein madde kaldırmak için kloroform ekstraksiyon ve daha sonra daha sonra kullanmak üzere çöktürülmüş ve su yeniden süspanse: fenol ile zenginleştirilmiş DNA arındırılır. IP amplifikasyon ürünleri analiz ederek ve eksikliği bilinen ve metil dizileri içerdiği bilinen bölgeler için DNA&#39;nın MeDIP prosedürün etkinliğini doğrulamak için PCR teknikleri kullanılabilir. Saflaştırılmış metillenmiş DNA lokus spesifik (PCR) veya genom (mikroarray ve sıralama) metilasyon çalışmaları için kullanılan ve gen ekspresyon profili ve dizi karşılaştırmalı genom hibridizasyonu gibi diğer araştırma araçları ile birlikte uygulandığında (özellikle yararlıdır CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. DNA metilasyon içine daha fazla araştırma da, aberrantly metillenmiş DNA ile karakterize olan kanser gibi hastalıklar için yeni tedavi veya prognostik araştırma araçları geliştirilmesinde yararlı olabilir, yeni epigenetik hedefler, keşfine yol açacaktır<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

DNA metilasyon paternlerinin belirlenmesi, metilasyonun ... üzerinde önemli etkilere sahip olduğu bilindiğinden, epigenetik çalışmalarında yaygın bir prosedürdür.

Bu video, metillenmiş DNA immünopresipitasyonu veya meetup için bir protokolü göstermektedir. Bu yöntem, metillenmiş DNA'yı tarafsız bir şekilde spesifik olarak izole etmek için kullanılır. Memelilerde DNA metilasyonu, sitozinin C5 pozisyonuna bir metil grubunun eklenmesi ile karakterize edilir.Bir CpG dinükleotidinde mevcut olduğunda, DNA metilasyonu hem normal gelişimde hem de çeşitli hastalık süreçlerinde önemli bir rol oynayan geri dönüşümlü bir epigenetik işarettir. DNA metilasyonunun normal işlevleri arasında dişilerde X kromozomu inaktivasyonu, tekrarlayan elementlerin susturulması, genomik imprinting ve genomik stabilitenin korunması yer alır. DNA metilasyonunun ayrıca kanser, de la Chapelle sendromu, Angelman sendromu ve immün yetmezlik, sentromerik instabilite ve yüz anomalileri sendromu gibi çok sayıda hastalıkta rol oynadığı gösterilmiştir.Örneğin kanserlerde, anormal hipermetilasyon ve promotörler, hayati tümör baskılayıcı genlerin susturulmasıyla sonuçlanabilir. Uygunsuz hipometilasyon ise kromozomal instabiliteye ve onkogen aktivasyonuna yol açarken, işlem öncelikle DNA'nın 300 ile 1000 baz çifti arasında değişen boyutlarda fragmanlara sonikasyonla parçalanmasıyla gerçekleştirilir. Sonike edilen DNA daha sonra 95 degrees Celsius'ta denatüre edilir.Beş primli metazin'i tanıyan primer antikorlar eklenir ve metillenmiş DNA fragmanlarına bağlanmalarına izin verilir. Primer antikor tarafından bağlanan DNA fragmanlarını izole etmek için manyetik dyna bead'lere konjuge edilmiş sekonder antikorlar kullanılır. Metillenmemiş fragmanlar uzaklaştırılır ve antikorlar proteinaz ile sindirilir.KA fenil kloroform temizliği sindirilmiş proteini uzaklaştırır ve çöktürme işlemi, artık metillenmiş fragmanlar açısından zenginleşmiş olan DNA'yı saflaştırır. Ardından, DNA; PCR mikroarray ve sekanslama gibi uygulamalar için kullanılabilir. İşlem genellikle iki günlük bir prosedür olarak gerçekleştirilir.Birinci gün DNA hazırlama, sonikasyon immünopresipitasyonu ve protein sindirimini içerir. İkinci gün, metilasyon açısından zenginleştirilmiş DNA'yı saflaştırmak ve izole etmek için pH kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesini içerir. Silikonize santrifüj tüpleri, bir DNA sonikasyon cihazı, primer antikor, anti-5' metil-CpG fare monoklonal antikoru, koyun anti-US IgG ile konjuge edilmiş sekonder antikor ve manyetik tüp rafı dahil olmak üzere kurulum için gereken birkaç özel materyal bulunmaktadır.Meetup protokolündeki ilk adım DNA'nın hazırlanmasıdır. DNA'nın yapısının önceden değerlendirilmesi zorunludur. Örnek DNA'nın durumunun, öncelikle çift zincirli mi yoksa tek zincirli mi olduğunun bilinmesi gerekir; çünkü örneğin doğru şekilde miktarının belirlenmesi büyük önem taşımaktadır ve DNA miktarını belirlemeye yönelik çeşitli yöntemler, istenmeyen DNA türlerinin varlığından olumsuz etkilenebilir.Çift sarmallı DNA miktarı, bir NanoDrop 3000 kullanılarak spektral fotometre ile kolayca değerlendirilebilir; 1.5 µL yükleyin ve ölçüm tipini nükleik asit olarak ayarlayın, hesaplama yöntemi olarak DNA 50'yi seçin ve cihazı 1.5 µL su ile başlatın. Pedestalları temizleyin ve cihazı 1.5 µL sıvı ile sıfırlayın. Örnek çözüldükten sonra pedestalları temizleyin, 1.5 µL örnek yükleyin ve ölç düğmesine basın.Konsantrasyon verilecek ve kullanılabilir. İhtiyaç duyulan mikrolitre miktarını hesaplamak için, burada 1,8'lik bir A260/A280 oranı idealdir. 1 µg'lık bir örnek hazırlanır.Bununla birlikte, başarılı sonuçlar elde etmek için 200 nanogram kadar az bir örnek yeterlidir. Hazırlık için, DNA örneğini temiz, silikonize bir tüpe yükleyin. Final hacmini 50 microliters seviyesine getirmek için yeterli miktarda steril su ekleyin.DNA'nın ve proteinlerin tüp duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için DNA sonikasyonu ve immünopresipitasyon silikonlanmış tüplerde gerçekleştirilmelidir. DNA hazırlandıktan sonra, immünopresipitasyon daha küçük DNA fragmanlarıyla daha verimli olduğundan, DNA'yı fragmanlara ayırmak için numuneye sonikasyon uygulanmalıdır; numuneyi sonikatöre yerleştirin, güç ayarının yüksek olduğundan ve makinenin 30 saniye çalışma, 30 saniye bekleme şeklinde ayarlandığından emin olun. Tabanı, dolum çizgisine kadar 4 °C suya doldurun.Numuneyi yedi dakika boyunca sonike edin. Sonikasyon işlemi tamamlandığında, tüpü çıkarın ve buza yerleştirin. Öngörülen numune ve DNA boyutuna göre sonikasyon koşullarını önceden optimize etmek önemlidir.Örneğin, kısmen degrade olmuş bir DNA örneği daha kısa bir sonikasyon süresi gerektirecektir. Sonikasyon ürünleri standart elektroforetik tekniklerle görselleştirilebilir. Bu aşamada, daha sonra kullanılmak üzere uzunlukları 300 ile 1000 baz çifti arasında değişen DNA fragmanları istenir.Mikrodizi ve PCR analizlerinde, DNA'nızın beşte birini girdi veya referans DNA olarak ayırmalısınız; bu durumda, immünopresipitasyon için 800 nanogram sonike DNA kullanılacak ve geri kalanı referans DNA olarak kenara ayrılacaktır. Medya protokolündeki bir sonraki adım immünopresipitasyon veya IP reaksiyonudur; primer antikor eklenmeden önce DNA denatüre edilmelidir. Primer antikor tek zincirli DNA'ya karşı duyarlı olduğu için denatürasyon gereklidir.Numuneyi 95 °C sıcaklıktaki bir benmariye 10 dakika boyunca yerleştirin. Denatürasyon adımı tamamlandığında, tüpü derhal en az beş dakika boyunca buza aktarın. Bu işlem, denatüre olan DNA'nın yeniden bağlanmasını önleyecek ve numune soğuduğunda optimal antikor bağlanmasına olanak sağlayacaktır.İçeriği dibe çöktürmek için tüpü kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, primer antikor eklenmelidir. Kullanılan antikor miktarı, her parti ve her üretici için titrasyonla belirlenmelidir.Bu durumda, beş mikrogram primer antikor ekliyoruz ve ardından nihai hacmi 500 mikrolitreye tamamlayacak şekilde immünopresipitasyon tamponu veya IP tamponu ekliyoruz. Ardından, IP DNA bir rotatora yerleştirilir ve dört derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edilmeye bırakılır. İnkübasyon sırasında tüp içerisinde antikor kümelenmesini önlemek için rotasyon gereklidir.Birincil antikor inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık 15 dakika önce, manyetik dyna bead'leri temizleyin ve hazırlayın. İlk olarak, flakondaki bead'leri vorteksleyerek tamamen yeniden süspande edin. Ardından, 30 µL bead'i temiz bir silikonize tüpe aktarın ve bu tüpü çoklu reaksiyonlar için bir manyetik rafa yerleştirin.Reaksiyon başına 30 microliters boncuk aktarın; pipetleme hatasını veya bazı boncukların istem dışı kaybını önlemek için bir ek reaksiyonluk miktar daha ekleyin. Örneğin, sekiz reaksiyon için dokuz reaksiyonluk boncuk veya 270 microliters miktarını alın.Manyetik boncuklar, manyetik rafın duvarına doğru çekilecektir. Boncukların göç etmesi ve tüp duvarında belirgin bir şerit oluşturacak şekilde çökmesi için iki dakika bekleyin. Ardından, pipet ucuyla arka duvardaki boncukları rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı dikkatlice çekip atın.Süpernatantı fazla miktarda IP tamponu ile değiştirin, vorteksleyin ve iki dakika boyunca tekrar manyetik rafa yerleştirin. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın ve yıkama boncuklarını orijinal IP tamponu hacminde yeniden süspande edin. İnkübasyon tamamlandığında numune tüpünü rotatörden çıkarın.İmmünopresipitasyonu tamamlamak için reaksiyona 30 µL temiz boncuk ekleyin ve tüpü dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca tekrar bir rotatora yerleştirin. Bu inkübasyon sırasında, anti-fare IgG olan sekonder antikor, primer fare antikora bağlanacaktır. Anti-fare antikorları manyetik dyna boncuklara konjuge edilmiştir, bu da bağlanan ürünlerin kolayca geri kazanılmasını ve ardından gelecek saflaştırma adımını sağlar.Her iki antikorla inkübasyon tamamlandığında, IP tüpünü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Bu aşamada, metillenmiş DNA birincil antikor tarafından bağlanmış olacak ve bu birincil antikor da dyna bead konjuge ikincil antikor tarafından bağlanmış olacaktır. Süpernatantı uzaklaştırıp atın ve yerine 500 µL IP tamponu ekleyin.Tüpün içeriğini karıştırın ve iki dakika boyunca tekrar rafa yerleştirin. Bu yıkama işlemini IP tamponu ile bir kez daha tekrarlayın. Son yıkamanın süpernatantını uzaklaştırdıktan sonra, boncukları son kez süspande edin.400 µL sindirim Tamponu içerisinde, reaksiyonu 100 µg proteinaz K ile işleme tabi tutun ve 50 °C'de gece boyunca inkübe edin. Proteinaz K işlemi, antikor proteinlerini ve DNA ile ilişkili her türlü kalıntı proteini sindirmek için gereklidir ve böylece metillendi DNA'nın çözeltiye salınması sağlanır. DNA saflaştırması, buluşma prosedürünün ikinci gününde gerçekleştirilir; sindirim tüpünü inkübatörden geri alın.Çeker ocak içerisinde, tüpe pH 7'de bire bir oranında fenol kloroformun 500 µL'sini ekleyin ve iyice vorteksleyin. Tüpü 13.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Arayüzü bozmadan veya organik fazdan herhangi bir miktar almadan, üstteki sulu fazı tüpten dikkatlice alın. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.Arayüz bulanık görünüyorsa ikinci bir ekstraksiyon yapılabilir. Ardından, üç molar sodyum asetatın onca hacmi, bu durumda 40 µL ekleyin. Pelet temizliğini kolaylaştırmak için taşıyıcı olarak 1 µL glikojen kullanılabilir.İçeriği karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Ardından iki hacim %100 etanol ekleyin, vorteksleyin ve dondurucuda -20 °C'de 20 dakika boyunca dondurun. Çökelen DNA, 13.000 G ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjle çöktürülür.Tüpün dibinde bir DNA peleti oluşacaktır. Tüpü santrifüjden çıkarın ve etanolü uzaklaştırın. Tüpün dibindeki pelete zarar vermemeye dikkat edin.Kalıntı Ethanol'ü uzaklaştırmak için kısa süreli bir santrifüj (pulse spin) gerekebilir. Peleti yıkamak için 500 µL soğuk, %70 ethanol ekleyip vorteksleyin ve 13,000 G'de, 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. İkinci santrifüj işlemi tamamlandığında, %70 ethanol'ü kısa süreli santrifüj ile çöktürün ve kalıntı ethanol'ü bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.Peletin kuruması ve kalan etanolün buharlaşması için tüpü kapağı açık şekilde bir raf üzerinde bırakın. Son olarak, yalnızca metilasyon için zenginleştirilmiş DNA içeren peleti 10 µL steril su ile yeniden süspande edin ve kullanmadan önce DNA peletinin çözünmesi için yeterli süre tanıyın. Elde edilen verimin yeterliliğini PCR ile doğrulamak iyi bir uygulamadır.Bu işlem, normal insan DNA primeri amplifikasyonu için metillenmiş ve metillenmemiş DNA fragmanlarını farklı şekilde gösteren ürünleri çoğaltmak üzere tasarlanmış PCR reaksiyonları yürütülerek gerçekleştirilebilir. H 19 imprinting kontrol bölgesi, genomun metillenmemiş bir bölgesini çoğaltmak için tasarlanmış primerlerle birlikte kullanılabilir. Örnek primer dizileri ve PCR döngü koşulları ekteki protokolde bulunabilir.Bu noktada, meetup protokolünün başlangıcında ayrılan giriş veya referans DNA'sını geri almak gerekir. PCR reaksiyonlarının bir seti giriş DNA'sı kullanılarak, diğer seti ise metilasyon için zenginleştirilmiş IP DNA'sı kullanılarak kurulacaktır. Meetup başarılı olduysa, IP PCR metilasyon primerleri kullanılarak bir ürün oluşturacak ve kontrol primerleri kullanılarak hiçbir ürün oluşturmayacaktır.Aksine, girdi PCR'ı hem metillenmiş hem de metillenmemiş DNA fragmanlarını içerdiğinden, her iki primeri kullanarak ürünler üretmelidir. Metillenmiş fragmanlar açısından zenginleştirilmiş DNA; PCR dizileme ve mikroarray analizi gibi bir dizi alt uygulama için kullanılabilir.Diğer moleküler biyoloji teknikleriyle entegre edildiğinde, metilasyon profilleme yapmak veya Epigenomiği incelemek amacıyla, DNA'nın metilasyon durumunun lokusa özgü veya genom genelinde araştırılması için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bu videoda, DNA örneklerinin bir naylon zar üzerinde lekelenmesi ve ardından monoklonal antikorlar kullanılarak görselleştirme yoluyla insan kondrositlerindeki DNA metilasyon seviyesini in vitro olarak belirlemek için nokta lekeleme tekniği açıklanmaktadır. Bu, kültürün çeşitli aşamalarında kondrositlerin fenotipini belirlemeye yardımcı olur.

DNA metilasyonunun derecesini belirlemek için 5-metilsitozin nokta lekesi

Geliştirilmiş İndirgenmiş Temsil Bisülfit Dizileme, sitozin bisülfit dönüşümü ile birleştirilmiş restriksiyon enzim sindirimine dayalı DNA metilasyon analizi için dizileme kitaplıklarının hazırlanması için bir yöntemdir. Bu protokol 50 ng başlangıç materyali gerektirir ve GC açısından zengin genomik bölgelerde baz çifti çözünürlük verileri verir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA metilasyonu, çeşitli uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda dinamik değişikliklere izin vermenin yanı sıra, gen ekspresyonunun stabil seviyelerini koruyabilir. DNA metilasyonundaki gene özgü değişikliklerin ve bu değişikliklerin gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veren teknikleri detaylandırıyoruz.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Öğrenin, metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) protokolünü kullanarak epigenetik araştırmalarda metillenmiş DNA fragmanlarını nasıl izole edeceğinizi. Bu yöntem, kanser ve gelişim biyolojisi çalışmalarında DNA metilasyon desenlerini incelemek için değerlidir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Daha fazla video keşfet