Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Bu video, metillenmiş DNA immünopresipitasyonu veya buluşması için bir protokolü göstermektedir. Metillenmiş DNA'yı tarafsız bir şekilde spesifik olarak izole etmek için kullanılan bir yöntem. Memelilerde DNA metilasyonu, sitozinin C beş pozisyonuna bir metil grubunun eklenmesi ile karakterize edilir.

Bir CPG dinükleotidinde mevcut olduğunda, normal gelişimde ve çeşitli hastalık süreçlerinde önemli bir rol oynayan geri dönüşümlü bir epigenetik işarettir. DNA metilasyonunun normal fonksiyonları arasında dişilerde X kromozomu inaktivasyonu, tekrarlayan element susturma, genomik damgalama ve genomik stabilitenin korunması yer alır. DNA metilasyonunun kanser, der Willi sendromu, engelman sendromu ve immün yetmezlik, sentrimerik instabilite ve yüz anomalisi sendromu gibi çok sayıda hastalıkta da rol oynadığı gösterilmiştir.

Örneğin kanserlerde, anormal hipermetilasyon ve promotörler, hayati tümör baskılayıcı genlerin susturulmasına neden olabilir. Uygun olmayan hipometilasyon, kromozomal instabilite ve onkogen aktivasyonu ile sonuçlanırken, ilk sonik paten, DNA'nın boyutları 300 ila 1000 baz çifti arasında değişen parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Sonikasyonlu DNA daha sonra 95 santigrat derecede denatüre edilir.

Beş asal metazini tanıyan birincil antikorlar eklenir ve metillenmiş DNA fragmanlarını bağlamasına izin verilir. Manyetik dyna boncuklarına konjuge edilen ikincil antikorlar, birincil antikor tarafından bağlanan DNA parçalarını izole etmek için kullanılır. Metillenmemiş fragmanlar çıkarılır ve antikorlar proteinaz tarafından sindirilir.

KA fenil kloroform temizliği, sindirilmiş proteini uzaklaştırır ve çökeltme, şimdi metillenmiş fragmanlar için zenginleştirilmiş olan DNA'yı saflaştırır. Meetup, DNA, PCR mikrodizisi ve dizileme gibi uygulamalar için kullanılabilir. Meetup genellikle iki günlük bir prosedür olarak gerçekleştirilir.

Birinci gün DNA hazırlığı, sonikasyon, immünopresipitasyon ve protein sindirimini içerir. İkinci gün, metilasyon için zenginleştirilmiş DNA'yı saflaştırmak ve izole etmek için pH kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesini içerir. Silikonize santrifüj tüpleri, bir DNA sunasyon cihazı, birincil antikor, anti beş prime metazin faresi, monoklonal antikor, ikincil antikor, koyunlara konjuge dyna boncukları, anti-US IgG ve manyetik tüp rafı dahil olmak üzere buluşma için gerekli olan birkaç özel malzeme vardır.

Buluşma protokolünün ilk adımı DNA'nın hazırlanmasıdır. DNA'nın doğasını önceden değerlendirmek zorunludur. Numune DNA'sının durumunu bilmek, öncelikle çift sarmallı mı yoksa tek sarmallı mı olduğunu bilmek gereklidir, çünkü numunenin doğru miktar tayini son derece önemlidir ve DNA miktarını belirlemeye yönelik çeşitli yöntemler istenmeyen DNA türlerinin varlığından olumsuz etkilenebilir.

Çift sarmallı DNA miktarı, NanoDrop 3, 300 nd yük 1.5 mikrolitre kullanılarak spektral fotometri ile kolayca değerlendirilebilir ve ölçüm tipini nükleik asit olarak ayarlayın, hesaplama olarak DNA 50'yi seçin ve cihazı 1.5 mikrolitre su ile başlatın. Kaideleri temizleyin ve cihazı 1,5 mikrolitre sıvı ile boşaltın. Numune içinde çözülür, kaideleri temizleyin, numuneden 1.5 mikrolitre yükleyin ve ölçüyü vurun.

Konsantrasyon verilecektir ve kullanılabilir. Benim için gereken mikrolitre sayısını hesaplamak için, burada iki 60'a iki 80 oranı 1.8'e kadar idealdir. Bir mikrogramlık bir numune hazırlanır.

Bununla birlikte, başarılı sonuçlar elde etmek için 200 nanogram kadar küçük bir numune yeterlidir. Buluşma için, DNA örneğini temiz bir silikonlu tüpe yükleyin. Yeterince steril su ekleyin Son hacmi 50 mikrolitreye getirmek için.

DNA Sonikasyonu ve immünopresipitasyon, DNA ve proteinlerin tüp duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için silikonlu tüplerde yapılmalıdır. DNA hazırlandıktan sonra, DNA'yı parçalamak için numunenin sonik sonikasyon olması gerekir, çünkü immünopresipitasyon daha küçük DNA parçalarıyla daha verimlidir, numuneyi sonikat içine yükleyin, güç ayarının yüksek olarak ayarlandığından emin olun ve makinenin 30 saniyeye ayarlandığından emin olun. 30 saniye kapalıyken, tabanı dört santigrat derece su ile doldurma çizgisine doldurun.

Numuneyi yedi dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyon bittiğinde, tüpü çıkarın ve buzun üzerine koyun. Beklenen numuneniz, DNA boyutunuz için Sonication koşullarını önceden optimize etmek önemlidir.

Örneğin, kısmen bozulmuş bir DNA örneği daha kısa bir sonikasyon süresi gerektirecektir. Sonication ürünleri standart elektroforetik tekniklerle görselleştirilebilir. Boyutları 300 ila 1000 baz çifti arasında değişen DNA parçaları bu noktada daha sonra kullanılmak üzere arzu edilir.

Mikrodizi ve PCR tahlillerinde, giriş veya referans DNA olarak hizmet etmek için DNA'nızın beşte birini ayırmalısınız, bu durumda immünopresipitasyon için 800 nanogram sonikasyonlu DNA kullanılacak ve geri kalanı referans DNA olarak bir kenara bırakılacaktır. Medya protokolündeki bir sonraki adım, birincil antikorun eklenmesinden önce immünopresipitasyon veya IP reaksiyonudur, DNA'nın denatüre edilmesi gerekir. Denatürasyon gereklidir çünkü birincil antikor tek sarmallı DNA'ya duyarlıdır.

Numuneyi 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Denatürasyon adımı tamamlandığında, tüpü hemen en az beş dakika buza aktarın. Bu, denatüre DNA'nın Reen'in diz çökmesini önleyecek ve numune soğuduğunda optimal antikor bağlanmasına izin verecektir.

İçeriği dibe çekmek için tüpü kısa bir süre döndürün. Daha sonra, birincil antikor eklenmelidir. Kullanılan antikor miktarı her parti ve her üretici için titre edilmelidir.

Bu durumda, beş mikrogram primer antikor ekliyoruz ve daha sonra 500 mikrolitrelik bir nihai hacme immünopresipitasyon tamponu veya IP tamponu ekliyoruz. Daha sonra, IP DNA'sı bir döndürücüye yerleştirilir ve iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edilmeye bırakılır. İnkübasyon sırasında tüp içinde antikor kümelenmesini önlemek için rotasyon gereklidir.

Primer antikor inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık 15 dakika önce, manyetik dinamik boncukları temizleyin ve hazırlayın. İlk olarak, flakondaki boncukları iyice yeniden askıya alın Girdap ile. Daha sonra 30 mikrolitre boncukları temiz bir silikonlu tüpe aktarın ve bu tüpü çoklu reaksiyonlar için manyetik bir rafa yerleştirin.

Reaksiyon başına 30 mikrolitre boncuk aktarın, ayrıca pipetleme hatasına veya bazı boncukların yanlışlıkla kaybolmasına izin vermek için ek bir reaksiyon için yeterlidir. Örneğin, sekiz reaksiyon için. Dokuz reaksiyon veya 270 mikrolitre için yeterli boncuk çıkarın.

Manyetik boncuklar, manyetik rafın duvarına doğru çekilecektir. Boncukların göç etmesi ve tüp duvarında tanımlanmış bir çizgiye yerleşmesi için iki dakika bekleyin. Ardından, Pipet ucuyla arka duvardaki boncukları rahatsız etmediğinizden emin olarak süpernatan pipeti dikkatlice çıkarın ve atın.

Süpernatanı fazla miktarda IP tampon girdabı ile değiştirin ve iki dakika boyunca manyetik rafa geri koyun. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın ve yıkama boncuklarını orijinal IP tampon hacminde yeniden süspanse edin. Kuluçka bittiğinde numune tüpünü Rotator'dan alın.

İmmünopresipitasyonu tamamlamak için, reaksiyona 30 mikrolitre temiz boncuk ekleyin ve tüpü dört santigrat derecede iki saat boyunca bir döndürücüye geri yerleştirin. Bu inkübasyon sırasında, anti fare IgG olan ikincil antikor, birincil fare antikoruna bağlanacaktır. Anti fare antikorları, manyetik dinamik boncuklara konjuge edilir, bu da bağlı ürünlerin kolay geri kazanılmasına ve saflaştırma adımının takip edilmesine olanak tanır.

Her iki antikorla inkübasyon tamamlandıktan sonra, IP tüpünü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Bu noktada, metillenmiş DNA, kendisi de dyna boncuk konjuge ikincil antikoru tarafından bağlanacak olan birincil antikor tarafından bağlanacaktır. Süpernatanı çıkarın ve atın ve 500 mikrolitre IP tamponu ile değiştirin.

Tüpün içindekileri karıştırın ve iki dakika boyunca tekrar rafa yerleştirin. Bu yıkamayı IP tamponu ile bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanı son yıkama Resus'tan çıkardıktan sonra, boncukları son kez askıya alın.

400 mikrolitre sindirim tamponunda, reaksiyonu 100 mikrogram proteinaz K ile tedavi edin ve gece boyunca 50 santigrat derecede inkübe edin. Proteinaz K tedavisi, antikor proteinlerini ve DNA ile ilişkili herhangi bir kalıntı proteini sindirmek için gereklidir ve metillenmiş DNA'nın çözeltiye salınmasına izin verir. DNA saflaştırması, buluşma prosedürünün ikinci gününde gerçekleştirilir, sindirim tüpünü inkübatörden alın.

Bir davlumbazda, tüpe pH yedide 500 mikrolitre bire bir feno kloroform ekleyin ve tüpü 13.000'de 10 dakika boyunca iyice döndürün. G. Arayüzü bozmadan veya organik tabakanın herhangi birini çıkarmadan üst sulu fazı tüpten dikkatlice çıkarın. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.

Arayüz bulanık görünüyorsa ikinci bir çıkarma işlemi yapılabilir. Daha sonra, bu durumda 40 mikrolitre üç molar sodyum asetatın 10. cildini ekleyin. Pelet temizliğini kolaylaştırmak için bir mikrolitre glikojen taşıyıcı olarak kullanılabilir.

İçeriği karıştırmak için tüpü girdaplayın. Daha sonra iki hacim% 100 etanol ekleyin, girdap yapın ve donduktan sonra eksi 20 santigrat derece dondurucuda 20 dakika dondurun. Çökeltilmiş DNA, 20 dakika boyunca 13.000 G ve dört santigrat derecede bir santrifüjde döndürülür.

Tüpün dibinde bir DNA peleti oluşacaktır. Tüpü Santrifüjden alın ve etanolü çıkarın. Tüpün altındaki peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.

Kalıntı Etanolü çıkarmak için bir darbe dönüşü gerekebilir. Peleti yıkamak için 500 mikrolitre soğuk,% 70 etanol girdabı ekleyin ve 13.000 G ve dört santigrat derecede 20 dakika tekrar döndürün. İkinci sıkma işlemi tamamlandığında, %70'lik etanol darbe dönüşünü çıkarın ve kalan etanolü bir pipetle çıkarın.

Peleti kurutmak ve kalan etanolün buharlaşmasını sağlamak için Tüpü kapağı açık bir rafta bırakın. Son olarak, Reus, yalnızca metilasyon için zenginleştirilmiş DNA ve 10 mikrolitre steril su içeren peleti askıya alarak, DNA peletinin kullanımdan önce çözünmesi için yeterli zaman tanır. Buluşma yeterliliğini PCR ile doğrulamak iyi bir uygulamadır.

Bu, normal insan DNA primerlerinin amplifiye edilmesi için metillenmiş ve metillenmemiş DNA fragmanlarını farklı şekilde gösteren ürünleri amplifiye etmek için tasarlanmış PCR reaksiyonları çalıştırılarak yapılabilir. H 19 baskı kontrol bölgesi, genomun metillenmemiş bir bölgesini amplifiye etmek için tasarlanmış primerlerle birlikte kullanılabilir. Örnek, primer dizileri ve PCR döngü koşulları ekteki protokolde bulunabilir.

Bu noktada, buluşma protokolünün başında bir kenara bırakılan girdi veya referans DNA'yı almak gerekir. Bir PCR reaksiyonu seti, giriş DNA'sı kullanılarak kurulacak ve diğer set, metilasyon için zenginleştirilmiş IP DNA'yı kullanacaktır. Buluşma başarılı olursa, IP PCR, metilasyon primerlerini kullanan bir ürün üretecek ve kontrol primerlerini kullanan bir ürün üretmeyecektir.

Tersine, giriş PCR'si, hem metillenmiş hem de metillenmemiş içerdiğinden her iki primeri de kullanan ürünler üretmelidir. DNA parçaları. Metillenmiş fragmanlar için zenginleştirilmiş DNA, PCR dizilimi ve mikrodizi analizi gibi bir dizi alt uygulama için kullanılabilir.

Diğer moleküler biyoloji teknikleriyle entegre edildiğinde, metilasyon profili oluşturma veya Epigenomik çalışma için DNA'nın metilasyon durumunu lokusa özgü veya genom çapında araştırmak için kullanılabilir.