Name: 一个磁性的系绳系统，以调查在果蝇的视觉和嗅觉介导的飞行控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解嗅觉磁性系绳装置（OMT）用于研究果蝇嗅觉行为的方法。该装置通过精确对齐磁铁和气味端口，使果蝇能够在视觉刺激存在的情况下自由追踪气味，从而深入探索昆虫嗅觉处理的神经机制。

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由美国国家科学基金会提供资助（M.F.）。

引言
OMT 是一种磁力牵引系统的改进版本[1]，旨在整合“虚拟气味羽流模拟器”。以下方案将详细说明如何正确牵引果蝇（第1部分），以及设置磁体（第2部分）和质量流量调控的气味递送系统（第3部分）的策略。本文所述信息针对该特定系统进行了优化，若使用其他技术参数的组件，操作细节可能有所差异。
第1部分：固定果蝇
此处所述的固定步骤与许多先前的研究类似[2]，但已针对光镊显微镜（OMT）[3]的应用进行了调整。正确的固定对于确保实验的稳定性和可重复性至关重要。仔细进行固定的重要性再怎么强调也不为过。
<ol>
	<li>收集羽化后4-6天的果蝇，并使其饥饿4-6小时。在无食物的试管中放入一张用水润湿的Kimwipe，以防止果蝇脱水。</li>
	<li>将一批果蝇从培养瓶转移至小试管中，插入设定在约4摄氏度的帕尔帖冷却装置的黄铜块内。适当温度可在约30秒内使果蝇麻醉。</li>
	<li>在冷却装置的冷表面上对果蝇进行分选。使用湿润的Kimwipe可确保持续冷却并从体壁吸收水分。选择体型最大的雌性果蝇用于固定。</li>
	<li>使用细毛刷将单只果蝇推入特制的棺形装置中，该装置专为容纳一只野生型雌性果蝇而设计。 
	<img alt="静力平衡示意图，包含旋转力；物理学研究中的 ΣFx=0, MA=0 概念" src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	图1。 
	<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">请点击此处查看该图的放大版本。</a></li>
	<li>我们将一根微细针（Fines Science Tools）固定在显微操作器上的磁性杆上。针的位置应调整至其钝端接触果蝇头部后方、两翅之间的背部胸节。从正前方观察眼睛时，针应完全垂直。果蝇与针之间即使存在轻微的“翻滚”倾斜也不可接受。从侧面观察时，针与果蝇身体长轴之间的角度应相对于水平线呈30度的抬头角（图1）。注意：为了在磁悬浮系统中实现最佳操作，可能需要将针剪短至更合适的长度，具体取决于悬挂磁铁之间的距离。</li>
	<li>当微细针对准后，使用一根细钢丝在微细针的钝端施加少量紫外光激活胶水（ElectroLite Corp）。</li>
	<li>移动针头，使胶滴接触果蝇头部上方的胸部。若胶滴大小合适，胶水应从针头退火并流至胸部表面。注意不要使用过多胶水。</li>
	<li>用两次各20秒的紫外光照射固化胶水。</li>
	<li>将固定好的果蝇暂时放置一旁，重复上述步骤。将Kimwipe切成小方块，用镊子为每只固定的果蝇放置一块，以限制其飞行。</li>
	<li>经过一小时恢复后，固定的果蝇即可用于实验。</li>
	<li>不恰当的粘接可能会影响果蝇在磁悬浮装置中的表现。每次实验开始时，均应检查每只果蝇是否能够平稳旋转，以确保粘接正确。可通过旋转具有足够大空间周期的条纹图案来诱发强烈的视动反应[4]进行检测。如果果蝇的粘接角度俯仰不当，或相对于翻滚轴存在倾斜，则可能出现以下情况：(i) 果蝇完全无法旋转；(ii) 运动范围受限；或 (iii) 旋转速度不稳定。出现上述情况时，应弃用该果蝇并更换新的个体。若更换果蝇后问题解决，则极可能是由于粘接不当所致。（如果更换果蝇后问题仍然存在，请参见第2.4部分）</li>
</ol>
第二部分：磁体的对齐
正确排列磁铁（Rare-earth-magnets.com）对于果蝇实现平滑的360度运动范围至关重要。请按照以下步骤正确排列磁铁。
<ol>
	<li>下部环形磁铁由塑料套管水平固定，并直接放置在一个透明的真空室顶部（图1；详见第3部分）。上部杆状磁铁垂直固定，位于下部磁铁上方约3/4英寸处。</li>
	<li>通过将上部杆状磁铁置于下部环形磁铁中心点正上方，目视粗略对齐上下磁铁。建议将上部磁铁连接至微操作器（Siskiyou Inc.），以便进行精细调节。</li>
	<li>在上部磁铁底面用环氧树脂粘接一个V型宝石轴承（Small Parts），以最小化旋转摩擦并标准化果蝇的定位。</li>
	<li>将一只果蝇放入实验区域，调整上部磁铁的水平和垂直位置，直至果蝇能够在偏航轴上平稳、连续地旋转360度。每次实验开始时，应对每只果蝇检查其旋转是否顺畅，以确保磁铁正确对齐且个体使用的微小固定针无损伤（见第1.11部分）。若磁铁未正确对齐，果蝇可能出现以下情况：(i) 完全无法旋转；(ii) 运动范围受限；(iii) 旋转速度不一致。如果更换果蝇后问题消失，则很可能源于粘接不当（见第1部分）。如果所有果蝇均出现上述问题，则可能是磁铁对齐问题，需进一步调整。</li>
	<li>警告：尽管操作稀土磁铁可能很有趣，但它们非常危险。不当使用可能导致设备损坏和/或轻微人身伤害。请务必极度谨慎对待这些看似无害却极易被低估的磁铁。</li>
</ol>
第3部分：气味递送
<ol>
	<li>气味递送系统基于先前描述的一种系统 [5]，是优化过程中最具挑战性的部分（图 1）。该过程需要极大的耐心并反复进行试错。请按照以下步骤实现稳定的气味追踪。</li>
	<li>气味系统的初始设置需要将细径特氟龙管（Small Parts）从气体多路复用器（Sable Systems International）连接至自行设计的水/气味小瓶。这些小瓶的出口通过相同的特氟龙管直接连接至皮下注射端口管。</li>
	<li>在实验区域下方放置一个透明亚克力真空室以支撑磁铁。我们在果蝇下方安装一根 4 mm 玻璃管，并将其连接至真空室，使真空开口更接近果蝇，并减小开口直径。</li>
	<li>使用镊子将一只固定果蝇放入实验区域内。</li>
	<li>开启一种吸引性气味（苹果醋效果良好），并通过肉眼观察确认果蝇是否追踪该气味。如果果蝇对该气味似乎无偏好，则执行接下来的三个步骤。此过程可能需要使用多只果蝇并进行多次试验。</li>
	<li>调整气味端口的位置，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们将气味端口安装在微操纵器（Siskiyou Inc.）上，并将其定位在果蝇头部背侧 4 mm、前侧 3 mm 处。</li>
	<li>调整质量流速，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们的设定值为 7 ml/min（Sable Systems International MFC-4）。</li>
	<li>调整真空流速，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们使用流量调节器（Cole Parmer）将真空流速设定为 13 l/min。注意：构建的真空供气管线可能随时间发生波动，导致气味羽流结构不稳定。为保持恒定的真空流速条件，建议将外部真空泵连接至流量调节器。</li>
	<li>当端口位置和流速设定完成后，使用气体多路复用器周期性地在水蒸气和气味蒸气之间切换，并通过肉眼观察确认果蝇仅在气味开启时进行追踪。有时，气味端口内部残留的气味可能在气味关闭时仍引发追踪行为。此问题可在不移除已准确定位的气味端口的情况下解决：将乙醇注入皮下注射管，并在递送端用 Kimwipe 纸巾收集；随后使用压缩空气吹出残留乙醇，即可继续实验。</li>
</ol>
代表性结果：
正确执行这些步骤后，应观察到两种现象。首先，在持续旋转的视觉刺激下，固定在OMT中的果蝇应沿偏航轴平稳地旋转360度。果蝇在无持续视觉刺激时表现出的“跳跃式”转向（称为扫视）是其自发转向行为的特征。如果果蝇明显无法平稳旋转，可能的原因包括粘附不当（见第1部分）或磁体未对准（见第2部分）。其次，当开启气味时，果蝇应朝向气味方向移动；当关闭气味时，果蝇应自发进行扫视，且在 arena 中无特定位置偏好。如果果蝇不能主动追踪气味羽流，则可能需要调整气味出口的位置、气流速率和/或真空流速（见第3部分）。

<ol><li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li>
<li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li>
<li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li>
<li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li>
<li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li>
</ol>

将果蝇固定并在该实验装置中引发稳定的嗅觉追踪行为相对简单，但需要练习、耐心以及反复尝试。该装置的许多部分均可进一步优化或替换，从而拓展实验的潜在应用。例如，更新版本的真空室体积更小，可为装置下方留出更多空间。此外，还可略微调整稀土磁铁的强度和类型，并增加额外的气味通道，以提升实验中可使用的气味种类和（或）浓度数量。需要注意的是，任何设备上的改动均需进行针对性的优化。如本文所述，该嗅觉-运动追踪装置（OMTA）可使用户检测视觉线索对气味定位的影响。通过LED面板系统可呈现多种多样的视觉刺激，再结合气味递送系统的灵活性与可扩展性，该装置具备在多个层面上研究视觉-嗅觉整合的潜力。该系统还丰富了日益增多的果蝇定量行为检测方法，尤其适用于飞行成虫行为的表征研究。

<table><tbody><tr><td>冷却阶段</td><td>Teca</td><td>LHP-300CP</td><td></td></tr><tr><td>黄铜冷却块</td><td>定制</td><td></td><td>约 4 x 8 x 2 cm</td></tr><tr><td>密封腔体（Sarcophagus）</td><td>定制</td><td></td><td>详情请联系我们</td></tr><tr><td>紫外激活胶</td><td>Kemxert corp</td><td>KOA300</td><td>1 盎司瓶装可使用多年</td></tr><tr><td>面板系统</td><td>Caltech</td><td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td><td>[4]</td></tr><tr><td>微型固定针（Minutien Pins）</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>下部环形磁铁</td><td>Rare-earth-magnets.com</td><td>NSN0615</td><td>5 - 0.75&quot;外径 x 0.375&quot;内径 x 0.125&quot;</td></tr><tr><td>上部杆状磁铁</td><td>Rare-earth-magnets.com</td><td>NSN0750</td><td>0.125&quot; x 1&quot;</td></tr><tr><td>V型宝石轴承</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>VJ-0469-01</td><td></td></tr><tr><td>MFC-4 流量调节器</td><td>Sable Systems International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气体多路复用器</td><td>Sable Systems International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>特氟龙管</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>STT-20-C</td><td></td></tr><tr><td>20 号皮下注射针管</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-20R-06</td><td></td></tr><tr><td>玻璃管</td><td></td><td></td><td>4 mm 外径</td></tr><tr><td>真空流量调节器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-32464-52</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究果蝇视觉与嗅觉介导飞行控制的磁力牵引系统

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

多年来人们已经明确，昆虫利用视觉线索在气流中稳定其飞行方向。许多动物会追踪由风携带的气味。因此，逆风追踪过程中的视觉稳定直接有助于气味追踪。但嗅觉信号是否能够独立于风力线索，直接影响视觉追踪行为？此外，近年来关于果蝇（Drosophila）嗅觉神经生理学与神经行为遗传学的研究激增，推动了技术上更为精密且定量化的行为检测方法的发展。在此，我们对原本用于视觉实验的磁悬浮系统进行了改进，在实验装置中引入了狭窄的层流气味流。将果蝇粘附于一根细钢针上，并将其悬浮于磁场中，使其能够自由偏航转动。将小直径的食物气味流自上而下引导至果蝇头部，可引发饥饿果蝇产生稳定的追踪行为。本文重点介绍固定装置的关键机械结构、磁体的对准、气味流的构建，以及稳定气味追踪行为的验证方法。

本文介绍了如何在嗅觉磁力固定装置（OMT）中固定果蝇。我们描述了如何对齐稀土磁铁和气味通道，以及如何设定刺激递送和真空抽吸的气体质量流速，以实现最佳的气味追踪效果。

多年来，人们已经明确昆虫会利用视觉线索在气流中稳定其飞行方向。许多动物会追踪随风传播的气味。

Joof 嗅觉研究领域的不断发展推动了行为检测技术日益精进，例如嗅觉磁力固定装置（olfactory magnetic tether apparatus，简称 OMT）。该实验步骤包括将果蝇背部胸节粘附至一根 mnuchin 针上，使果蝇以 30 度角悬挂，针的角度需调整至适当俯仰，随后将其置于两块稀土磁铁之间进行对齐。若操作正确，果蝇将能够自由活动。随后调整气味通道，使气流从释放喷嘴平滑地经过果蝇头部进入真空室。接着在视觉刺激存在的情况下，测试果蝇定位气味物质的能力。大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校生理科学系 Mark Fry 博士实验室的 Brian DeMars。今天我们将向您展示如何固定果蝇，以便在嗅觉磁力悬浮装置中使用。我们还将演示如何校准磁铁和气味通道，并设置气味输送系统的质量流量速率。我们在实验室中采用此方法研究果蝇的视觉和嗅觉介导的飞行控制。现在让我们开始。首先，收集羽化后4至6天的果蝇，并使其饥饿4至6小时。将一批标记的果蝇转移至一个含有湿润Kimwipe纸以防止干燥的食物管中。接着，将该小管插入设置在4°C的帕尔贴冷却装置的黄铜块中。在此温度下，果蝇将在约30秒内被麻醉。在冷却台上放置一张吸水纸以吸收水分。接着将麻醉后的果蝇置于台上进行分选，挑选体型最大的雌蝇用于固定。使用细毛刷将一只果蝇推入特制的棺形装置中，该装置专为容纳一只野生型雌性果蝇而设计。现在使用显微镜确认果蝇已正确放置，背侧朝上。果蝇的前端应朝向您，后端远离您。接下来，将带有磁性杆的明钦针安装在显微操作仪上并进行定位。应将大头针的钝端对准果蝇的背部胸节，即头部后方两翅之间的位置。果蝇在大头针上的位置需在三个轴向上均摆放正确。俯仰角、翻滚角和偏航角应调整至在正对眼睛观察时，针完全垂直，即使蝇与针之间存在微小的翻滚角也不可接受。从侧面观察时，针与身体长轴之间的夹角，即俯仰角，应相对于地平线保持30度的抬头角度。请注意，为了实现最佳的 tether 操作，可能需要对针进行适当修剪。这取决于悬浮磁铁之间的距离。一旦将 Mnuchin 针对齐，使用一根细钢丝在 Mnuchin 针的钝端施加一滴紫外光活化胶。然后调整针的位置，使胶滴接触果蝇胸部头部正上方的区域。注意不要使用过多胶水。使用适量的胶滴时，胶水应能从针尖流下并覆盖在胸部。接着，用两段持续22秒的紫外光照射固化胶水。固定完成后，使用镊子将一小块方形擦镜纸递给每只果蝇，果蝇会因本能的降落反射而抓住擦镜纸。固定后的果蝇经过一小时恢复，即可用于实验。为了实现平滑的360度运动范围，正确对齐磁体至关重要。为此，使用塑料套管水平固定下部环形磁体，并将其直接放置在透明真空腔室的顶部。上部杆状磁体垂直固定，位于下部磁体上方约四分之三英寸处，一个V型双轴承通过环氧树脂粘附在上部磁体的底面。这将标准化果蝇的定位并尽量减少旋转摩擦。请注意，这些磁

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一个磁性的系绳系统，以调查在果蝇的视觉和嗅觉介导的飞行控制

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