Name: Un In Vitro Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Aprende el ensayo de irritación cutánea in vitro con el modelo EpiDerm de epidermis humana reconstruida. Este método validado reemplaza las pruebas en animales para evaluar la seguridad de cosméticos y productos farmacéuticos mediante el ensayo MTT.

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Los autores desean agradecer a ZEBET en el BfR (Alemania), BASF SE (Alemania), IIVS Inc. (EE.UU.), LSL-Zet (Austria) para participar en Multi-centro de estudio de validación internacional de la SIT Modificado EpiDerm (5 ).

I. Acondicionamiento de los tejidos - Día 0 <ol><li> Tras la recepción de la epidermis del PAI-200-SIT, accede a todos los componentes del kit para la integridad (para más detalles véase el cuadro kit de reactivos y equipos específicos). </li><li> Por cada tres tejidos EpiDerm, preparar una estéril de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo. </li><li> En condiciones estériles, abra la bolsa de plástico que contiene la placa de 24 pocillos que contienen los tejidos EpiDerm y retire la gasa estéril. </li><li> Usar pinzas estériles para eliminar cada inserción que contiene el tejido EpiDerm y el lugar de inserción en el vacío de 24 pocillos. Durante este paso, eliminar cualquier resto de agarosa de envío que se adhiere a los lados exteriores de la pieza por suaves secante sobre papel de filtro estéril. </li><li> Dentro de los próximos 5 minutos, una inspección visual de los tejidos. No utilice los tejidos defectuosos o tejidos que están completamente cubiertas de líquido. </li><li> Utilizando un hisopo de algodón punta estéril, seque la superficie de los tejidos. Trate de no tocar directamente el tejido - efectos capilares son suficientes para eliminar la humedad de la superficie del tejido. </li><li> Después de secar la superficie del tejido, la transferencia de tres tejidos de la fila superior de las placas de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo. Liberar las burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos. </li><li> Coloque las placas de 6 pocillos que contienen los insertos en la incubadora por un 60 ± 5 min de pre-incubación a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de HR (Humedad Relativa). </li><li> A finales de los 60 ± 5 min de pre-incubación período, la transferencia de los insertos de los pozos de alta en los pozos inferior de la placa de 6 pocillos. Coloque las placas de nuevo en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) para una noche de pre-incubación (18 ± 3 horas). </li><li> Coloque el resto del medio de cultivo en el refrigerador (5 ± 3 ° C). Después de la noche a la mañana la pre-incubación, la sustancia de ensayo se puede aplicar a los tejidos EpiDerm. Nota: El procedimiento de pre-incubación puede acortarse en caso de entrega tardía del tejido (por ejemplo, si los tejidos llegan el miércoles en lugar del martes). </li></ol> II. Exposición a sustancias químicas - Día 1 <ol><li> Prepare una placa de 6 pocillos por cada sustancia de ensayo mediante la cumplimentación de la fila superior sólo con 0,9 ml por pocillo de medio de cultivo. </li><li> Aproximadamente 5 minutos antes de la exposición prevista a los productos químicos, quitar las placas de 6 pocillos que contienen los tejidos pre-acondicionado de la incubadora. </li><li> Evaluar la superficie de los tejidos y eliminar la humedad con puntas de algodón estéril. </li><li> Etiqueta de todas las tapas placa de 6 pocillos con los códigos de ensayo de materiales o nombres. </li><li> Dosis de los tejidos con la sustancia de ensayo a intervalos de 1 minuto para facilitar el lavado de los productos químicos de prueba después de la exposición. Mantener las placas con los tejidos dosis en la campana estéril, hasta el último tejido se dosifica. </li><li> Para probar los productos químicos líquidos, prescindir de 30 l de la solución directamente sobre el tejido y colocar la malla de nylon en la superficie de los tejidos. Si es necesario, con cuidado la posición de la malla con el bulbo de vidrio dirigido pipeta Pasteur. No presione sobre la superficie del tejido. </li><li> Para las pruebas semi-sólidos, el uso de una pipeta de desplazamiento positivo para prescindir de 30 l directamente sobre el tejido. Si es necesario difundir la sustancia química con la pipeta Pasteur para cubrir la superficie del tejido tanto como sea posible. </li><li> Para los materiales sólidos, poco antes de la aplicación de la sustancia problema, humedezca la superficie del tejido, con 25 l de DPBS estéril. Esto permitirá mejorar el contacto de la superficie del tejido con la sustancia de ensayo. Llene una cuchara de 25 mg calibrado aplicación aguda (o cualquier otra herramienta apropiada), con aproximadamente 25 mg de material finamente pruebas en tierra. Aplicar la sustancia de ensayo sólidas a la superficie del tejido. Si es necesario, utilice una lámpara de cabeza con una pipeta Pasteur para vaciar la cuchara por completo. Agite suavemente los insertos para mejorar la difusión de los sólidos en la superficie. </li><li> El caso de sustancias de consistencia cerosa, tratar de formar un piso "cookie como" pieza de 8 mm de diámetro y colóquelo sobre el tejido, que se humedece previamente con DPBS estéril. Para mejorar el contacto entre la sustancia de ensayo y el tejido, pesan la "cookie" con un acero inoxidable o de plástico ayuda. </li><li> Aplicar DPBS como control negativo y el 5% SDS como control positivo en los tejidos control. </li><li> Después de la administración del tejido pasado, la transferencia de todas las placas durante 35 ± 1 minutos de la incubadora humidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa). </li><li> Después de los 35 ± 1 minutos de incubación a 37 ° C retirar todas las placas de la incubadora. Coloque las placas en la cubierta estéril y esperar hasta que un período de 60 minutos de exposición química se ha completado para el primer tejido dosificado. </li><li> Después de iniciar el procedimiento de lavado con la inserción de un intervalo de tiempo por minuto (para segurose que el tiempo total de exposición de cada inserción es de 60 minutos). </li><li> Utilice una botella de lavado para lavar los tejidos con DPBS estéril. Rellene el tejido insertar 15 veces mediante el uso de un flujo constante de DPBS y se vacía. (Nota: para los tejidos con una malla de nylon, lave la superficie del tejido 5 veces y retire la malla cuidadosamente con las pinzas de punta, afilada Después, continúe con el resto de 10 lavados). </li><li> Después del 15 de enjuague con la botella de lavado, sumergir completamente la inserción de 3 veces en 150 ml de DPBS y agitar para remover el resto del material de ensayo. </li><li> Por último, enjuagar la inserción del tejido una vez desde el interior y una vez que desde el exterior con DPBS estéril. </li><li> Eliminar el exceso de DPBS del tejido agitando suavemente la inserción, y borrando en el papel secante estéril. </li><li> La transferencia de los insertos de tejido borrados de la nueva placa de 6 pocillos previamente pre-llenado con medio de cultivo. Todos estos pasos (14-18) se debe hacer dentro de 1 minuto para cada inserción. </li><li> Después del último tejido se aclara, seque la superficie de cada tejido con un algodón estéril con punta de algodón. </li><li> Incubar los tejidos en la incubadora para los próximos 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa). Nota: Cada técnico ensayo no debe probar más de 6 sustancias de prueba, incluyendo los controles negativos y positivos en una carrera de prueba solo (juego), para poder seguir el protocolo que se describe a continuación </li></ol> III. Intercambio de soportes - Día 2 <ol><li> Después de las 24 ± 2 horas post-incubación, la transferencia de los insertos en la parte inferior de la placa de 6 pocillos, precargada con 0,9 ml de los medios de comunicación. Los medios de comunicación de las filas superiores pueden ser recogidos para el análisis de los criterios de valoración adicionales (citocinas, quimiocinas, etc.) El análisis de los criterios de valoración secundarios es opcional. </li><li> Continuar con la post-incubación (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) por 18 ± 3 horas. </li></ol> IV. MTT ensayo de viabilidad - Día 3 <ol><li> Etiqueta de dos placas de 24 pocillos con los nombres químicos o códigos. Una placa servirá para la incubación del tejido con MTT y el otro para la etapa de extracción. </li><li> Prepare la solución de MTT por el deshielo del concentrado de MTT (5 mg / ml) y diluir con el diluyente MTT. La concentración final de solución MTT es de 1 mg / ml. </li><li> Pipetear 300 L de solución de MTT en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. </li><li> Retire las placas de 6 pocillos de la incubadora, mancha el fondo de los insertos en un papel secante, y transferirlos a la placa de 24 pozos pre-llenado con MTT. </li><li> Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) y se incuba durante 3 horas ± 5 min. Se adhieren estrictamente a las 3 horas ± 5 min tiempo de incubación para evitar la desviación entre las lecturas MTT diferentes. </li><li> Cuando la incubación MTT, se debe utilizar una bomba de succión para aspirar suavemente el medio MTT de todos los pozos. </li><li> Rellenar los pozos con DPBS y aspire de nuevo. Repita este lavado dos veces más y asegurarse de que los tejidos se sequen después de la aspiración última. </li><li> Después de los lavados de transferencia de los insertos de una nueva placa de 24 pocillos. Sumerja los insertos pipeteando suavemente 2 ml de solución de extracción (isopropanol) en cada inserción. El nivel se elevará por encima de los bordes superiores de la inserción, por lo tanto completamente sumergido en los tejidos. </li><li> Sellar la placa de 24 pocillos (por ejemplo, con Parafilm o el uso de la bolsa de sellado) para inhibir la evaporación de extracción. Extracto de la MTT de los tejidos por lo menos 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador de placas (~ 120 rpm). Extracción de la noche sin agitación también puede ser utilizado. </li><li> Después del período de extracción, perforar los insertos con una aguja de inyección o una bombilla de cuentas pipeta Pasteur y permitir que el extracto para correr en el pozo de donde se tomó la inserción. </li><li> Deseche el inserto perforado y una pipeta la solución en el bien de arriba abajo tres veces hasta que sea homogénea. </li><li> Para cada tejido, la transferencia de dos alícuotas de 200 l de la solución de violeta de formazán en una placa de fondo de microtitulación de 96 pocillos plana. La transferencia de los duplicados de acuerdo con el diseño de la placa fijo establecido en la hoja de cálculo que acompaña a este protocolo de video. Para los blancos, el uso de isopropanol. </li><li> Lea la densidad óptica (DO) de los extractos de MTT en un espectrofotómetro de placa de 96 pozos con una longitud de onda de 570 nm (540 a 580) sin un filtro de referencia. </li><li> Introducir los resultados en la hoja de cálculo para el cálculo automático de los resultados (Figura 1). </li><li> Una sustancia de ensayo es como 'irritante' (R38 o categoría del SGA 2) si la viabilidad de los tejidos por ciento determinado por el ensayo MTT es &lt;50% con respecto al control negativo. Nota: MTT es tóxico, así que asegúrese de usar guantes protectores cuando maneje. Proteger MTT y su modoluciones de la luz, ya MTT es sensible a la luz. Use una solución de MTT en unas pocas horas después de su preparación ya que se degrada con el tiempo. </li></ol> Calidad V. Ensayo controles <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT kit Criterios de Aceptación: En modelos in vitro CHE deben proporcionar datos consistentes, de alta calidad con el tiempo, no sólo durante el proceso de validación (8). Las pautas recomendadas para asegurar la reproducibilidad a largo plazo del ensayo y el rendimiento son "una caracterización completa de las células o los tejidos, el muestreo de cada lote ... para el desempeño, y el uso regular de los controles y las sustancias químicas de referencia para ofrecer garantías de coherencia de sus resultados del ensayo" (9) . Además de los criterios de aceptación del ensayo se describen a continuación, cada lote de producción de EpiDerm es el control de calidad probado por el fabricante en contra de una sustancia química de referencia adicionales (1% Triton X-100). El tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad del tejido al 50% (ET-50) de Triton X-100 se determina. Para EpiDerm, promedio anual ET-50 los valores han oscilado entre 5,9 horas y 7,5 horas. El lote de CV muchos de los tejidos de control negativo (es decir, la variabilidad de la viabilidad de referencia) tiene un promedio inferior a 7,5% por cada año desde 1996. El valor ET50 de cada lote de producción debe estar dentro de dos desviaciones estándar de la media histórica Triton X-100 ET50 establecido en 1996 (es decir, ET-50 = 6,7 horas; límite inferior de aceptación = 4.8h; límite de aceptación superior = 8.7h) con el fin de ser liberado para su uso por el fabricante. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 1: Control negativo: El OD absoluta del control negativo (NC) tejidos (tratados con DPBS estéril) en el MTT-test es un indicador de la viabilidad del tejido obtenido en el laboratorio de pruebas, después del transporte y el almacenamiento de los procedimientos y condiciones específicas de uso. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la media de la DO 570 de los tejidos NC es ≥ 1,0 y 2,5 ≤. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 2: Control Positivo Una solución al 5% de SDS (en H 2 O) se utiliza como control positivo (PC) y prueba al mismo tiempo que la sustancia de ensayo. Medios concurrentes que el PC tiene que ser probado en cada ensayo, pero no más de un PC se requiere por día de pruebas. La viabilidad del control positivo debe ser dentro de un intervalo de confianza del 95% de los datos históricos. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la viabilidad media de los tejidos PC expresado en% de los tejidos de control negativo es del 20%. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 3: Desviación Estándar (SD) La irritación de la piel se predice a partir de la viabilidad media determinada sobre tres tejidos individuales y por lo tanto, la variabilidad de los tejidos replica debe ser aceptablemente bajo. El ensayo cumple con el criterio de aceptación si la SD calculado a partir de cada viabilidades% del tejido de los tres tratados de forma idéntica réplicas es &lt;18%. </li></ul> Resultados representante <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3"> </div> Figura 1 Los resultados obtenidos durante 6 artículos de prueba, Carolina del Norte y el control de PC -. Parte de la hoja de cálculo automatizado para el cálculo de los resultados. Las sustancias de ensayo que reducía la viabilidad del tejido por debajo del 50% hace referencia a NC se clasifican como sustancias irritantes. La prueba ha sido optimizado para proporcionar resultados que sean lo suficientemente lejos de la clasificación de corte (50% de viabilidad) lo que aumenta la robustez del ensayo. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiales </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Lista de Materiales">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Los autores son empleados de la corporación MatTek, que produce reactivos y herramientas utilizados en este artículo.

En este vídeo, se ha demostrado la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para las pruebas in vitro irritación de la piel de sustancias químicas, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. Al llevar a cabo este método, es importante trabajar en condiciones de asepsia y seguir estrictamente el protocolo validado, ya que la desviación del protocolo puede provocar resultados diferentes. Algunas de las modificaciones de la prueba es posible, sin embargo, los cambios en el protocolo se tratarán directamente con los autores. La única limitación de este método es una posible interferencia de la sustancia problema con el extremo de MTT. Una sustancia de color o una que reduce directamente el MTT (y por lo tanto imita la actividad de la deshidrogenasa de la mitocondria celular) puede interferir con el extremo de MTT. Sin embargo, estas sustancia son un problema sólo si en el momento de la prueba de MTT (es decir, 42 horas después de la exposición de la sustancia) una cantidad suficiente de la sustancia todavía están presentes en (o dentro) de los tejidos. En el caso de este improbable caso, la reducción (true) MTT metabólicas y el aporte de un material de prueba de color o (falsa) de reducción de MTT directa por el material de prueba se puede cuantificar mediante un procedimiento descrito en detalle en el Procedimiento de Operación Estándar de ensayo proporcionado por MatTek Corp.

un in vitro</empiel> prueba de irritación (sit) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (che) modelo

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

El ensayo de irritación cutánea EpiDerm (EpiDerm SIT) se desarrolló<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Y validado<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Para<em&gt; In vitro</emLa piel&gt; irritación de ensayos de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. El SIT EpiDerm utiliza el 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruida epidérmico humano (CHE) EpiDerm modelo. El procedimiento descrito en este protocolo permite la discriminación entre los agentes irritantes de la categoría 2 del SGA y no irritantes<sup&gt; (6)</sup&gt;. La prueba se realiza a lo largo de un período de tiempo de 4 días, que consiste en la pre-incubación, 60 minutos de exposición, 42 horas después de la incubación y el ensayo de viabilidad MTT. Después de la recepción de tejidos y la noche de pre-incubación (día 0), los tejidos son sobre temas expuestos a la sustancia de ensayo (día 1), que puede ser líquido, semi-sólidos, sólidos o cera. Tres tejidos se utilizan para cada sustancia de ensayo, así como para el control positivo (5% aq. Solución de SDS), y un control negativo (DPBS). Exposición a productos químicos tiene una duración de 60 minutos, 35 minutos de que los tejidos se mantienen en una incubadora a 37 ° C. Las sustancias de ensayo se retiran de la superficie del tejido mediante un procedimiento de lavado intensivo. Las inserciones de tejido son borrados y se transfieren a un medio fresco. Después de un período de incubación de 24 horas (día 2), el medio se cambia. El medio se pueden guardar para su posterior análisis de las citocinas o los puntos de interés. Después del intercambio de soportes, los tejidos se incubaron durante 18 horas. Al final de la 42h todo después de la incubación (día 3), los tejidos se transfieren a una solución MTT amarilla y se incubó durante 3 horas. La resultante púrpura-azul sal de formazán, formado principalmente por el metabolismo mitocondrial, se extrae durante 2 horas con isopropanol. La densidad óptica de formazano extraída se determinará mediante un espectrofotómetro. Un producto químico está clasificado como un irritante si la viabilidad del tejido en relación con los tejidos tratados de control negativo se reduce por debajo del 50%. Este procedimiento puede ser utilizado como reemplazo total de la prueba in vivo de conejo irritación de la piel para la identificación de peligros y etiquetado de productos químicos en línea con las regulaciones de la UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

En este video, se demuestra la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para<em&gt; In vitro</emLa piel&gt; irritación de ensayos de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos.

Un In Vitro</emPiel> Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo

La prueba de irritación cutánea EpiDerm (EpiDerm SIT) fue desarrollada (1,2,3) y validada (4,5) para el ensayo de irritación cutánea in vitro de sustancias químicas, incluyendo...

Epiderm es un modelo reconstruido in vitro del epidermis humano, derivado de células humanas normales, desarrollado por la Corporación Matt Tech. El protocolo validado EC VM del ensayo de irritación cutánea con Epiderm sustituye las pruebas tradicionales basadas en animales para productos como cosméticos, materias primas y agentes industriales que entrarán en contacto con la piel humana. Este ensayo comienza en el día cero, cuando el kit de irritación cutánea y el tejido Epiderm llegan al laboratorio y posteriormente se preincuban en un medio de ensayo tras una incubación nocturna.El día uno, la superficie atípica del tejido epidérmico se expone durante una hora a un compuesto irritante putativo y luego el irritante se elimina mediante un paso de lavado el día dos. Tras una incubación de 24 horas, el inserto de cultivo se coloca en medio fresco y el medio antiguo puede utilizarse para el análisis de citocinas y quimioquinas liberadas. El tejido se trata con un compuesto conocido como MTT, que es convertido por la reductasa mitocondrial en una sal de formazán de color púrpura oscuro.Proporciona un indicador de viabilidad celular. La ausencia de color púrpura oscuro en la muestra indica una viabilidad reducida. Cuando la lectura colorimétrica de un compuesto de prueba es inferior al 50 % de los controles negativos, el compuesto de prueba puede clasificarse como un irritante.Hola, soy Helena Kava de Matt Corporation. Hoy les mostraré el procedimiento para la prueba de irritación cutánea in vitro utilizando el modelo de epidermis humana reconstruida epiderm. Este procedimiento, según los requisitos regulatorios, puede utilizarse como reemplazo total o parcial de la prueba in vivo de irritación cutánea rápida.Este nuevo procedimiento in vitro puede utilizarse para la identificación de peligros y el etiquetado de productos químicos y materiales cosméticos crudos. Así que comencemos. Epiderm se deriva de cultivos de queratinocitos epidérmicos humanos para formar un modelo tridimensional, multicapa y altamente diferenciado de la epidermis humana.Los tejidos son mitótica y metabólicamente activos, imitan estrechamente a sus contrapartes in vivo tanto estructural como bioquímicamente, y lo hacen con una reproducibilidad garantizada, como el epitelio humano. Epiderm consta de capas basales, espinosas y granulosas organizadas y una capa córnea estratificada. Esta última contiene capas lipídicas laminares intercelulares de Miller dispuestas en patrones análogos a los encontrados in vivo.Estos tejidos se cultivan en medio libre de suero. Cada tejido crece en un inserto individual para cultivo celular. Otras configuraciones están disponibles, incluyendo un formato de alto rendimiento de 96 pocillos.La producción del tejido tarda aproximadamente tres semanas en completarse. En un punto específico de este proceso, el tejido se eleva hasta la interfase aire-líquido y se elimina todo el líquido de la superficie APIC del tejido. Los tejidos son alimentados únicamente a través de la superficie basolateral, que permanece en contacto con el medio de cultivo exclusivo de Mat Tek. Un kit Epiderm típico contiene 24 tejidos, cada uno de nueve milímetros de diámetro, en su propio inserto para cultivo de tejidos, además del medio de ensayo suficiente para realizar esta prueba de irritación cutánea.Los 24 insertos están firmemente colocados sobre gel de AGA rosa infundido con medio, con un tejido en cada pocillo de una placa estándar de 24 pocillos. El envío se realiza mediante mensajería nocturna a una temperatura de tres a cuatro grados centígrados antes de comenzar las pruebas con productos químicos. Utilizando el sistema de prueba EPIDERM, prepare y esterilice todos los instrumentos y herramientas utilizados en el ensayo según se describe en el protocolo escrito. Una parte de los materiales, como los bastoncillos de algodón, debe venir en envases estériles o ser autoclavada.Se debe usar etanol al 70 % para esterilizar instrumentos como pinzas y se debe usar irradiación UV o gamma para esterilizar los frascos de lavado. Dos soluciones críticas utilizadas en el ensayo deben prepararse previamente: DPBS y una solución de SDS al 5 %. En agua destilada, se utilizarán aproximadamente dos litros de DPBS estéril con pH siete en el ensayo, utilizando un kit que contiene 24 tejidos epiderm.El DPBS estéril sirve como control negativo así como solución de lavado. Se debe preparar y utilizar SDS al 5 % como control positivo. El ensayo de irritación cutánea comienza tras la recepción del kit EPIDERM EPI 200 SIT.Asegúrese de verificar la integridad de todos los componentes del kit y comuníquese inmediatamente con la corporación Mat Tech si tiene alguna inquietud; si todo está presente, continúe con el siguiente paso. Para comenzar la prueba, deje que el medio de ensayo suministrado con el kit alcance la temperatura ambiente. No precaliente dentro de la cabina de flujo laminar.Prepare una placa estéril de seis pocillos por cada tres insertos de tejido epidérmico y pipetee 0,9 mililitros del medio de ensayo en cada pocillo bajo condiciones estériles. Abra la bolsa de plástico que contiene la placa de 24 pocillos con los tejidos epidérmicos bajo flujo de aire estéril. Retire la gasa estéril y utilice fórceps estériles para extraer cuidadosamente cada inserto que contenga el tejido epidérmico.Elimine cualquier resto de aros que se adhiera a los lados externos del inserto mediante un suave secado sobre gasa estéril o papel de filtro. Luego, coloque los tejidos en una placa estéril de 24 pocillos vacía dentro de los siguientes cinco minutos. Inspeccione visualmente los insertos.Registre cualquier defecto del tejido y exceso de humedad en la superficie. No utilice tejidos defectuosos ni tejidos completamente cubiertos con líquido.Insertos de tejido óptimos. Deben tener una superficie seca y estar libres de desprendimientos, partes irregulares o exceso de líquido en la superficie. A continuación, utilizando un hisopo estéril de algodón, seque cuidadosamente la superficie de los tejidos.Trate de no tocar directamente el tejido. Los efectos capilares son suficientes para eliminar la humedad de la superficie después de secarla. Transfiera tres tejidos a la fila superior de cada seis.Placa de pocillos precargada con 0,9 mililitros de medio de ensayo. Libere cualquier burbuja de aire atrapada debajo de los insertos. A continuación, coloque las placas de seis pocillos que contienen los insertos en el incubador durante una hora.Preincubación a 37 grados Celsius. Al finalizar el primer período de preincubación, transferir los insertos de los pozos superiores a los pozos inferiores de la placa de seis pozos. Volver a colocar las placas en el incubador para una preincubación nocturna.Coloque el resto del medio de ensayo en el refrigerador. Tras la preincubación nocturna, se pueden aplicar los productos químicos de prueba a los insertos de tejido epidérmico. Antes de comenzar el ensayo de exposición a productos químicos, coloque todos los dispositivos, soluciones y productos químicos de prueba necesarios a temperatura ambiente.En la cabina de flujo laminar, limpie con etanol al 70 % todos los frascos de materiales no estériles antes de colocarlos dentro de la cabina. El control negativo DPBS estéril, el control positivo con SDS al 5 % y el agua destilada deben colocarse dentro de la cabina a temperatura ambiente. Se debe apartar un frasco grande para residuos.Prepare una placa de seis pocillos para cada producto químico, llenando solo la fila superior con 0,9 mililitros de medio de ensayo por pocillo. Etiquete cada placa con el número de tejido y el nombre del producto químico.Aproximadamente cinco minutos antes de la exposición prevista a los productos químicos, retire las placas de seis pocillos que contienen los tejidos acondicionados del incubador. Luego, evalúe visualmente la superficie de los tejidos.Elimine cualquier humedad utilizando hisopos de algodón estériles y no presione sobre la superficie del tejido. Finalmente, etiquete las tapas de la placa de seis pocillos con los códigos o nombres de los materiales de prueba. No pruebe más de seis productos químicos, incluyendo controles negativos y positivos, cada uno en triplicado, en un solo ensayo.Utilice una aplicación química y un intervalo de lavado de un minuto para manipular sustancias de prueba conocidas. Siga las instrucciones proporcionadas en la hoja de datos de seguridad de materiales o MSDS para muestras codificadas o desconocidas. Siga las directrices de seguridad química y utilice un gabinete ventilado.Use guantes y proteja sus ojos y rostro. Aplique los tejidos con productos químicos a intervalos de un minuto para facilitar el enjuague de los productos químicos de prueba después de la exposición; mantenga las placas con los tejidos tratados en la cabina de flujo laminar hasta que se haya aplicado el último tejido. A lo largo del procedimiento se utilizará una pipeta con punta de bulbo para manipular el tejido y los compuestos de prueba. Puede utilizarse la flama de un mechero Bunsen para generar la punta en forma de bulbo para probar productos químicos líquidos.Dispense 30 microlitros del artículo de prueba líquido directamente sobre el tejido y comience inmediatamente el cronómetro para que cuente hacia adelante. Coloque la malla de nailon sobre la superficie del tejido cuando el cronómetro alcance un minuto, agregue el segundo compuesto líquido. Utilice tres tejidos por producto químico de prueba, recordando agregar cada compuesto a intervalos de un minuto.Para probar semisólidos, utilice una pipeta de desplazamiento positivo para dispensar 30 microlitros directamente encima del tejido. Si es necesario, extienda el producto químico con una pipeta Pasteur para que coincida con el tamaño del tejido. Poco antes de la aplicación de la sustancia sólida, humedezca la superficie del tejido con 25 microlitros de DPBS estéril para mejorar el contacto entre la superficie del tejido y el producto químico de prueba; llene una cuchara afilada de aplicación de 25 miligramos con el material de prueba finamente molido.Aplique el producto químico de prueba sólido sobre la superficie del tejido. Si es necesario, utilice una perilla estéril en la punta de su pipeta para vaciar completamente la cucharilla. Agite suavemente los insertos para mejorar la distribución del sólido sobre la superficie.También puede utilizar la punta de bulbo de su pipeta para ajustarse al tamaño del tejido. No presione sobre la superficie del tejido. Finalmente, aplique DPBS como control negativo y 5 %SDS como control positivo a los insertos de tejido, también por triplicado, después de administrar la última dosis al tejido, y transfiera todas las placas a un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 35 más o menos un minuto.Durante esta incubación, asegúrese de colocar todos los materiales necesarios para los pasos de lavado en la cabina. Tras la incubación de 35 minutos, retire todas las placas del incubador. Colóquelas en la cabina estéril y espere un período de 60 minutos para que se complete la exposición química en el tejido de la primera dosis.A continuación, inicie el procedimiento de lavado. Enjuague los tejidos con DPBS estéril 15 veces. Para eliminar cualquier material de prueba residual, llene el inserto de tejido utilizando un flujo constante de DPBS suministrado a 1,5 centímetros de distancia de la superficie del tejido y luego vacíelo.Asegúrese de que el flujo de DPBS no sea demasiado débil, ya que de lo contrario la sustancia de prueba no se eliminará. Recuerde mantener el intervalo de tiempo de un minuto para lavar cuatro tejidos con una malla de nailon cinco veces y retire cuidadosamente la malla con la pinza fina y puntiaguda. A continuación, continúe con los 10 lavados restantes después del 15.º, enjuague utilizando la botella de lavado, sumergiendo completamente el inserto tres veces con 150 mililitros de DPBS y agite para eliminar el resto del material de prueba.Finalmente, enjuague el tejido. Inserte una vez desde el interior y otra desde el exterior con DPBS estéril. Elimine cualquier exceso de DPBS del tejido agitando suavemente el inserto y secándolo sobre papel absorbente estéril.A continuación, transfiera los insertos de tejido transferidos a la nueva placa de seis pocillos previamente llenada con medio de ensayo. Recuerde nuevamente que todos estos pasos deben realizarse dentro del intervalo de un minuto para mantener el tiempo de exposición de 60 minutos para cada muestra expuesta. Después de enjuagar el último tejido, seque cuidadosamente la superficie de cada tejido con un hisopo estéril con punta de algodón.Si aún hay trazas de la sustancia química en la superficie, intente eliminarlas utilizando el hisopo de algodón estéril. Por último, incube los tejidos en la incubadora durante las próximas 24 horas. Registre la hora de inicio de la incubación en la hoja de documentación de métodos.Registre también todas las aplicaciones diferentes en la hoja de documentación del método. Anexe al procedimiento operativo estándar proporcionado por Mat Tech Corporation el movimiento de las placas en la cabina. Transfiera el inserto a la parte inferior de la placa de seis pocillos previamente llenada con 0,9 mililitros de medio.Recolecte el medio de la fila superior y transfiera mediante pipeta a una placa de 24 pocillos previamente etiquetada, la cual luego se coloca a menos 20 grados Celsius. Hasta el análisis, el análisis de citocinas y/o quimiocinas liberadas en el medio de cultivo es un paso opcional. Continúe con la incubación durante otras 18 más o menos tres horas para el ensayo de MTT; etiquete 2 placas de 24 pocillos con los nombres químicos o códigos.Recuerde que el MTT es tóxico, por lo que debe usar guantes de protección al manipularlo. Prepare la solución de MTT descongelando el concentrado de MTT y diluyéndolo con el diluyente de MTT.Proteja de la luz ya que el MTT es sensible a la luz y utilícelo dentro de las dos o tres horas siguientes. Dado que el MTT se degrada con el tiempo, pipete 300 microlitros de medio con MTT en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Ahora retire las placas de 6 pocillos del incubador.Seque el fondo de los insertos sobre un papel absorbente y transfiéralos a la placa de 24 pocillos previamente llenada con MTT. Coloque la placa de 24 pocillos en el incubador e incube durante tres horas. No olvide registrar la hora de inicio de la incubación con MTT en el MDS; cumpla estrictamente con el tiempo de incubación de tres horas para evitar obtener lecturas diferentes de MTT. Cuando finalice la incubación con MTT, utilice una bomba de succión con trampa para residuos tóxicos para aspirar suavemente el medio de MTT de todos los pocillos.Rellene nuevamente los pocillos con DPBS y aspire. Repita este lavado otras dos veces y asegúrese de que los tejidos estén secos tras la última aspiración. Después de los lavados, transfiera los insertos a una nueva placa de 24 pocillos e introduzca los insertos agregando cuidadosamente con pipeta dos mililitros de solución extractora en cada uno.El nivel ascenderá por encima de los bordes superiores del inserto, cubriendo así completamente los tejidos por ambos lados. Selle la placa de 24 pocillos utilizando un sellador térmico o parafina para inhibir la evaporación del extracto. Registre la hora de inicio de la extracción en la hoja de documentación de métodos y realice la extracción durante al menos dos horas a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador de placas. Una vez finalizado el período de extracción, perfore los insertos con una aguja de inyección o con la punta de bulbo de su pipeta y permita que el extracto fluya hacia el pocillo del que se extrajo el inserto.Deseche los insertos perforados y pipete la solución en el pocillo arriba y abajo tres veces hasta que esté homogénea. También se puede usar un agitador de placas ajustado a 120 rpm por cada tejido. Transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de la forma azul y la solución a una placa microtituladora de fondo plano de 96 pocillos.Transfiera los duplicados según el diseño fijo de la placa indicado en la hoja de cálculo que acompaña este protocolo en video para los blancos. Utilice isopropanol, lea la densidad óptica o DO en un espectrofotómetro para placas de 96 pocillos utilizando una longitud de onda de 570 nanómetros sin emplear un filtro de referencia. Ingrese los resultados en la hoja de cálculo para el cálculo automático de los mismos.Téngase en cuenta las correcciones debidas a la interferencia del producto químico de prueba según se describe en el protocolo adjunto; un producto químico de prueba se clasifica como irritante. Si el porcentaje de viabilidad del tejido es igual o menor al 50 % tras el análisis espectrofotométrico, la DO a 570 de los tejidos del control negativo (NC) es mayor o igual a 1 y menor o igual a 2,5, y la viabilidad media de los tejidos del control positivo (PC), expresada como porcentaje de los tejidos del control negativo, es menor al 20 %, y la desviación estándar (SD) calculada a partir de las viabilidades tisulares porcentuales individuales de tres réplicas tratadas de forma idéntica es menor al 18 %. Los compuestos que arrojan valores de viabilidad celular inferiores al 50 % pueden considerarse irritantes.Acabamos de mostrarle cómo realizar la prueba validada de irritación cutánea de 60 minutos y 42 horas con el modelo de piel humana reconstruida Epiderm. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la mayor parte de la prueba se lleva a cabo bajo condiciones estériles o asépticas. Si existe la necesidad de alguna modificación del método o si necesita una explicación más detallada de cualquiera de los pasos del procedimiento, no dude en contactarnos para obtener ayuda y asesoramiento.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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