Drosophila Sen Pupa Indirekte Flight Muscle (IFM) Dissektion: En metode til High-Throughput Tissue Collection

- I den voksne flue er de indirekte flyvemuskler eller IFMs fluens største muskler, der spænder over hele brystkassen.

For det første er de ryglige langsgående muskler, eller DLLM'er, placeret langs brystkassens medianplan over tarmen og spænder fra forreste til bageste. For det andet spænder de dorsale ventrale muskler eller DVMs fra toppen til bunden af brystkassen og flankeres af TDT eller hoppemusklen. Begge muskelgrupper er fastgjort til neglebåndet.

Med ca. 48 timer efter pupariumdannelse eller APF kan modning af IFMs visuelt identificeres med et simpelt dissektionsmikroskop. I eksempelprotokollen indsamler vi IFM'er fra pupper ældre end 48 timer APF til analyse af høj overførselshastighed.

- Til IFM dissektion efter 48 timers APF skal du bruge en let fugtet pensel til at overføre den iscenesatte pupper til en stribe dobbeltsidet klæbebånd monteret på et mikroskopdias. Orientere pupperne i en linje, ventral side ned, og forreste mod bunden af diaset. Når alle de pupper er blevet placeret, skal du bruge pincet til at drille fra hinanden og åbne den første pupal sag over den forreste spirakler, og forsigtigt skubbe et par tang dorsally mod posterior, skære pupal sagen som tang flytte.

Frigør puppen fra den åbnede kasse, og overfør straks puppen til en dråbe PBS på et andet mikroskop dias. Når alle pupperne er befriet, skal du bruge fin saks til at skære puppernes underliv væk fra brystkassen og skubbe underlivet i en separat bunke. Når alle brystkassen er fjernet, skal du bruge et stykke silkepapir til at fjerne størstedelen af PBS og bunken af maver.

Tilsæt en dråbe frisk kølet PBS til de resterende brystkasser, før du bruger saksen til at skære fra hovedet langs langs langsgående kropsakse i en enkelt bevægelse for at opdele brystkassen i halve.

Hold det første par pincet stille, brug fin saks til at skære den ene ende af IFM væk fra neglebånd og sener, før du roterer puppen 180 grader, så den anden ende af IFM kan skæres fri fra kutikula og sener. Brug pincet til at overføre IFM bundtet fra brystkassen til kanten af PBS boblen ved hjælp af vandspænding til at holde bundtet på plads.

Skub derefter slagtekroppen til den modsatte side af diaset og disseker resten af IFM'erne på samme måde. Når alle IFMs er blevet indsamlet, skal du bruge nummer fem pincet til at fjerne eventuelle hoppe muskel eller kutikula fragmenter, der kan have fundet vej ind i prøverne. Derefter bruge vandspænding til forsigtigt at fange dissekeret IFMs mellem et par pincet og placere IFMs i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder 250 mikroliter af kølet PBS.