FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

O objetivo deste procedimento é usar a técnica de hibridização de fluorescência in situ dois para determinar o cromossomo sexual ou o status de translocação de embriões humanos in vitro em risco de anormalidade genética. Isso é feito por lise, uma única célula biopsiada de um embrião do terceiro dia em uma lâmina de vidro e secagem ao ar do núcleo. O segundo passo é codificar a natureza D e hibridizar o DNA do núcleo alvo com sondas de DNA marcadas com fluorocromos de cores diferentes.

Em seguida, o excesso de sonda é removido usando uma lavagem rigorosa e o núcleo é corado com uma coloração fluorescente específica de DNA. A etapa final é visualizar o núcleo usando um microscópio de fluorescência e capturar imagens digitais. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o número de cópias das regiões cromossômicas alvo por meio de microscopia de fluorescência.

Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque ela está no limite da técnica de hibridização in situ de fluorescência. Com 24 horas de antecedência, prepare o tampão de lise celular para espalhar as células. Filtre a solução e dispense alíquotas de um mililitro em 10 a 15, 1,7 mililitro de microcentrífuga estéril feche e rotule os tubos antes de congelar a menos 20 graus Celsius pouco antes do procedimento de biópsia.

Descongele o tampão de lise à temperatura ambiente. Marque um pequeno círculo de aproximadamente cinco milímetros de diâmetro na parte inferior de uma lâmina revestida de amina usando uma caneta de diamante e, em seguida, usando um lápis duro de quatro H, pré-rotulou a lâmina BLO com uma luva de látex. Para remover qualquer pó de grafite, use uma lâmina separada para cada espelho blaster em ordem numérica.

Agora coloque um pequeno volume de tampão de lise dentro do círculo. Transfira o blaster de biópsia para o tampão de lise. Adicione o tampão de lise conforme necessário para lisar a célula.

Observe o núcleo para garantir que ele permaneça dentro do círculo e não seja perdido. Se a célula não tiver núcleo ou tiver vários núcleos, faça uma biópsia de outra célula. Deixe a lâmina secar ao ar em temperatura ambiente.

Primeiro, pré-lave as amostras em potes de coplan usando solução salina tamponada com fosfato por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue duas vezes em água destilada estéril, desidrate com uma série de etanol por dois minutos cada à temperatura ambiente e seque ao ar. Certifique-se de que as lâminas estejam totalmente imersas e, se algum pó de grafite flutuar na superfície, absorva com um lenço de papel limpo.

Registre a posição do núcleo dentro do círculo visualizando com um microscópio de contraste de fase. Em seguida, desidrate as amostras com etanol a 100% por dois minutos em temperatura ambiente e seque ao ar. Agora aplique dois microlitros de mistura de sonda e cubra com uma lamínula de nove por nove milímetros.

Sele as bordas da lamínula com cimento de borracha. Execute a naturação codificada. Pise em um bloco de calor a 75 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, hibridize durante a noite em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius para cada frasco de acoplamento.

Equilibre 50 mililitros de solução de lavagem rigorosa SSC a 0,4 vezes em banho-maria a 71 graus Celsius. Coloque o frasco de lavagem rigoroso e o frasco de acoplamento vazio no banho-maria em temperatura ambiente a 71 graus Celsius, pH a lavagem rigorosa e decantar em frascos de cochim. Proceda à remoção cuidadosa do cimento de borracha de cada lâmina e enxágue a lamínula usando quatro vezes SSC 0.05%tween 20 pH sete à temperatura ambiente.

Lave as amostras na lavagem rigorosa de 0,4 vezes SSC a 71 graus Celsius por cinco minutos, seguida de quatro vezes SSC 0,05% Tween 20 em temperatura ambiente por dois minutos. Para sondas que são marcadas indiretamente, drene as lâminas do excesso de líquido e aplique 20 microlitros de anticorpo conjugado fluorescentemente sob um quadrado de 20 por 20 milímetros de paraforma. Incube em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Remova o filme para e execute as seguintes lavagens em temperatura ambiente por dois minutos. Uma vez em quatro vezes SSC 0,05% entre 20 e duas vezes por dois minutos em PBS. Depois de drenar as lâminas, aplique seis microlitros de meio de montagem de blindagem vetorial contendo DPI a 22 por 22 milímetros.

Numere a lamínula zero e inverta o slide sobre a tampa. Seque e sele as bordas da lamínula com esmalte transparente. Por fim, analise as amostras por microscopia de fluorescência.

Pontue cada núcleo por dois analistas independentes. Use também software de imagem para capturar uma imagem do núcleo para confirmação do diagnóstico visual e para arquivamento de imagens como parte da garantia de qualidade do laboratório. Aqui, uma propagação metafásica e um núcleo interfásico preparado a partir de linfócitos do sangue periférico indicam um portador de uma translocação recíproca entre os braços curtos dos cromossomos cinco e nove com pontos de quebra em cinco P 14.3 e nove P dois, 4.1.

As sondas de peixes iluminam os segmentos translocalizados e o segmento cêntrico dos sinais do cromossomo nove. Na interface blástica meros núcleos do terceiro dia, os embriões podem ser capturados e depois mesclados para formar uma imagem composta. Dois sinais para cada sonda indicam duas cópias de cada locus, o que é consistente com um complemento normal ou balanceado.

Para os cromossomos de translocação, os sinais coloridos indicam uma cópia do segmento translocalizado do cromossomo cinco, três cópias do segmento translocalizado do cromossomo nove e duas cópias do segmento cêntrico do cromossomo CH nove. Esses dados são consistentes com um produto desequilibrado de man somi para cinco P 14,3 a cinco PT e trissomia para nove P dois, 4,1 a nove pt. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar uma única célula biopsiada de um embrião humano e preparar um único núcleo usando a técnica de hibridização in situ de fluorescência

Isso é importante para obter resultados de teste reprodutíveis e ideais para determinar o complemento cromossômico sexual ou o status de translocação de um embrião.