ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

מטרת הליך זה היא לייצר נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו, או r AAVs, להעברת טרנסגנים יעילים במבחנה או in vivo. זה מושג על ידי העברה ראשונה של תאי HEC 2 93 עם פלסמידים של DNA המקודדים את גן הטרנס והגנים הוויראליים. לאחר מכן מגרדים את התאים המועברים ומשקרים כדי לקצור את חלקיקי ה-RAAV המורכבים.

לאחר מכן, ה-R AAVs מטוהרים מליזאט התא באמצעות טיהור עמוד הפרין. השלב האחרון הוא להדק את מלאי הנגיפים. בסופו של דבר, התוצאות מראות ביטוי גן טרנס חזק ומתמשך בתיווך וירוס באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

בשלב זה, ה-RA AAV מוכנים ליישומי in vitro או in vivo. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה שלנו על פני שיטות טיהור אחרות, כגון טיהור שיפוע צזיום כלוריד, הוא שאיננו דורשים שימוש באולטרה-צנטריפוגה או בחומרים רעילים. אנו גם מניבים וקטורים ויראליים גבוהים וטהורים.

לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו פלסמיד באיכות גבוהה, מלאי DNA וצעקו לשלמות כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל צלחת שתי צלוחיות 80% COFLUENT 150 סנטימטר רבוע של HEC 2 9 3 תאים לחמישה צלחות תרבית רקמות NOC בקוטר 15 סנטימטר, תאי תרבית. ב-DMEM סטנדרטי עם גלוקוז נמוך המכיל 10% סרום עגל עוברי, כ-48 שעות לאחר הציפוי ביום הטרנספקציה צריך להיות מפגש של 70 עד 80% שלוש שעות לפני הטרנספקציה.

הסר את ה-DMEM והחלף במדיום ה-cho'S של מפרץ הקרח או IMDM המכיל סרום עגל עוברי של 5%. הכן את תערובת הטרנספקציה לאצווה אחת של וירוס כמתואר בפרוטוקול הכתוב במכסה המנוע של תרבית רקמות מסוג שני, מסנן את תערובת הטרנספקציה לתוך צינור של 50 מיליליטר תוך מערבולת התמיסה במהירות, הוסף 13 מיליליטר של ערימה כפולה. הוא חוצץ מי מלח.

החזר את המכסה של צינור ה-50 מיליליטר והמשיך למערבולת למשך 15 שניות. השאירו לעמוד דקה ו -45 שניות. צריך להיווצר משקע לבן הוסף בעדינות חמישה מיליליטר מתמיסת הטרנספקציה לכל צלחת תרבית רקמה בגודל 15 סנטימטר.

מערבבים את הצלחות לערבוב לאחר הדגירה למשך 16 שעות. הסר את IMDM, החלף ב-DMEM והמשך לדגור על התאים. לקצור את ה-R AAVs.

הסר את המדיה מצלחות תרבית התאים. 72 שעות לאחר ההעברה והשליכה תמיד יש לטפל בתמיסת Vercon או בחומר חיטוי מתאים אחר. שטפו בעדינות את התאים במי מלח חמים חד פעמיים פוספט.

הוסף 25 מיליליטר PBS חם לכל צלחת והסר בעדינות את התאים בעזרת מגרד תאים. לאחר איסוף התרחיף בצינורות של 50 מיליליטר, גלולה את התאים ב 800 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את השכיבה והשעו מחדש את הגלולה.

ב-10 מיליליטר של מאגר נתרן כלורי של 150 מילי-מולרי לכל צלחת תרבית רקמה, פצלו את התרחיף לשני צינורות של 50 מיליליטר. לאחר מכן טמונים תאים עם תמיסה טרייה שהוכנה של 10% נתרן דאוקסי קואט. לאחר מכן הוסף בנזואט נוקלאז להסרת חומצות גרעין.

לאחר ערבוב הצינורות דגרו היטב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה, הסר פסולת סלולרית על ידי צנטריפוגה ב -3000 פעמים G למשך 15 דקות. העבירו את הסופינאט לצינור טרי של 50 מיליליטר וודא שכל פסולת התאים הוסרה כדי למנוע חסימה של הפרין.

עמודות לטיהור r AAVs. 10 מיליליטר של נתרן כלורי חוצץ למזרק ומגדיר את עמודי הפרין המלכודת הגבוהה באמצעות משאבה פריסטלטית כך שהתמיסות זורמות דרך העמודה במהירות של מיליליטר לדקה. חשוב לוודא שלא יוכנסו בועות אוויר לעמוד הפרין.

אזנו את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר נתרן כלורי 150 מילי-מולרי. מרחו 50 מיליליטר תמיסת וירוסים על העמודה ואפשרו לתמיסה לזרום. לאחר מכן שטפו את העמוד עם 20 מיליליטר של מאגר נתרן כלורי 100 מילי-מולרי.

באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר. המשך לשטוף את העמודה עם מיליליטר אחד של 20 מילי-מולרי נתרן כלורי ואחריו מיליליטר אחד של 300 מילי-מולרי. השלכת הזרימה דרך.

השתמש במזרקים של חמישה מיליליטר ולחץ עדין כדי לסלק את הנגיף מהעמודה על ידי הפעלת מאגרי פליטה גבוהים יותר. אוספים את האלואט בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. רכז את הווקטור באמצעות AmCon Ultra ארבע יחידות סינון צנטריפוגליות עם חתך משקל מולקולרי של 100,000.

טען ארבעה מיליליטר של העמודה לתוך הרכז והצנטריפוגה ב -2000 פעמים G למשך שתי דקות. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, הנפח המרוכז צריך להיות כ -250 מיקרוליטר. השליכו את הזרימה וטענו מחדש את הרכז בתמיסת הנגיף שנותרה.

הוסף 250 מיקרוליטר PBS לנגיף לנפח סופי של 500 מיקרוליטר והוצא מהרכז. כשלב אחרון, סנן את הווקטור דרך מסנן מזרק בקוטר 13 מילימטר של 0.2 מיקרון כדי להדק את נגיף המלאי. הכן 18 תלושי כיסוי זכוכית מצופים פוליאול ליזין על ידי זריעת תאי HEC 2 9 3 כך שיהיו במקביל ל-40 עד 50% לטיטרציה של תלויי R AAVs.

השתמש בתאי HEC 2 9 3 המבטאים ביציבות את Cree recombinase. להדביק כל באר בדילול סדרתי של וקטור ה-RAAV כמתואר בפרוטוקול הכתוב באמצעות שלוש בארות לכל דילול לאחר 72 שעות, לתקן תאי HEC 2 9 3 על ידי הוספת נפח שווה של 4% עוצמה של פורמלדהיד למדיום למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS ופעם אחת במים מזוקקים. לאחר מכן בעזרת אמצעי הרכבה, הנח את החלקות הכיסוי על השקופיות.

צד התא כלפי מטה. ספרו את מספר התאים החפורים משלוש הבארות שיש להן את גורם הדילול הגבוה ביותר אך עדיין מכילות תאים נגועים. מצא את הממוצע של אלה והכפל בגורם הדילול כדי לתת את מספר היחידות הזיהומיות למיקרוליטר HEC 2 9 3 תאים שהומרו עם וירוס המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר.

בדרך כלל מושגים טיטרים עקביים של בערך פי שישה פי 10 עד ששת החלקיקים המדבקים למיקרוליטר. מוצגות כאן דוגמאות להזרקות סטריאוטקסיות של R AAVs תלויי Cree המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק לאזורי מוח שונים של עכברים טרנסגניים בוגרים של Cree. ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק ויראלי מוגבל לתאי עצב המבטאים קרי באזורי יעד שונים.

בדוגמה זו, תגובתיות חיסונית של חלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת בתלמוס הרשתית ובגלובוס פאלוס, בפיתול המשונן, ובאזור האחד של ההיפוקמפוס לאחר ששולטים בו. ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבעה עד שמונה ימים לייצור וירוס ושלושה ימים לטיטרינג אם מבוצעת כראוי.