Name: 活细胞成像的移植细胞在一个三维矩阵表示荧光标记的蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习活细胞成像技术，在三维胶原基质中观察荧光标记蛋白的定位与动态变化。该方法利用共聚焦显微镜实时追踪迁移细胞，为研究细胞迁移机制提供生理相关环境。

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感谢 Grant Sumida 博士对本文稿的审阅。本工作得到了贝克曼青年研究员奖（SY）、赫尔曼家族新教员奖（SY）、美国国立卫生研究院 EUREKA 奖以及加州大学癌症研究协调委员会的资助。

1. 稳定细胞系的构建（例如 MDCK 细胞）
<ol>
	<li>在 p35 培养皿中以 80–90% 汇合度接种细胞。避免细胞形成 100% 汇合的单层，否则会降低转染效率。</li>
	<li>使用 Lipofectamine 2000 将目的质粒转染至细胞中。根据制造商提供的方案优化转染条件。</li>
	<li>次日，将细胞传代至两个 p150 培养皿中。建议使用大培养皿，以便稳定克隆之间有足够的间距。</li>
	<li>次日，更换培养基，并向每个培养皿中加入 500 μg/ml 的 G418。G418 的浓度应根据不同的细胞系进行优化。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，持续约 2 周。2 周后，应开始出现对 G418 抗性的克隆，并可通过肉眼观察到。</li>
	<li>使用倒置荧光显微镜识别 GFP 阳性克隆。使用记号笔在培养皿上标记这些克隆的位置。</li>
	<li>为选择性地消化克隆，吸除培养基，并用 PBS 或胰蛋白酶溶液洗涤细胞两次。第二次洗涤时，不要完全吸除液体，保留一层薄液以防止细胞干燥。</li>
	<li>对于每个标记的克隆：使用无菌棉签尽可能贴近克隆边缘擦拭，形成一个包含细胞克隆的湿润区域孤岛。向克隆上加入 10 μl 胰蛋白酶。对每个克隆重复此操作，并迅速进行以避免干燥。经验丰富的研究人员通常可在每个 p150 培养皿中挑取约 12 个克隆。</li>
	<li>将培养皿在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，直至细胞从培养皿上脱落并呈圆形。</li>
	<li>对于每个克隆：向克隆上加入 10 μl 胰蛋白酶，上下吹打数次以使细胞脱离培养皿。然后将克隆中的所有细胞转移至 24 孔板中的单个孔内。</li>
	<li>待稳定克隆生长后，使用标准的蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光方法分析各克隆的蛋白表达情况。扩增这些细胞系以进行后续分析。</li>
</ol>
2. 玻璃底培养皿表面修饰以实现最佳胶原结合（可选）
<ol>
	<li>为对玻璃进行硅烷化处理，用移液器将300 μl的2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane溶液加入每个直径10 mm的p35培养皿的玻璃区域。硅烷化与交联示意图见图1。3-Aminopropyltrimethoxysilane使用过滤水稀释。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>吸除3-Aminopropyltrimethoxysilane溶液，并用过滤水洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>吸除水分，将培养皿置于50 °C加热板上加热1.5小时。将培养皿盖稍偏移放置，以便皿内湿气逸出。</li>
	<li>从加热板上取下培养皿，使其冷却至室温。</li>
	<li>向每个培养皿的玻璃区域加入300 μl的2%戊二醛溶液。戊二醛使用PBS稀释。</li>
	<li>孵育1小时。</li>
	<li>吸除戊二醛溶液，并用PBS洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>通过紫外线照射1小时对培养皿进行灭菌。硅烷化处理后的培养皿可在室温下储存。</li>
</ol>
3. 含示踪颗粒的三维胶原凝胶的制备
<ol>
	<li>将100 μl示踪颗粒原液（1010 颗粒/ml）在离心机中以15,000 rpm离心5分钟，洗涤荧光示踪颗粒，吸除上清液后加入500 μl培养基，重复此步骤5次。最后一次洗涤后，将颗粒重悬于30 μl培养基中。</li>
	<li>常规方法用胰蛋白酶消化表达GFP的细胞。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬至约2 × 106 细胞/ml。</li>
	<li>用移液器将240 μl生长培养基加入一个Eppendorf管中。</li>
	<li>依次加入12.6 μl 1 M Hepes、20 μl过滤水、50 μl细胞悬液，然后加入10 μl荧光颗粒。</li>
	<li>最后加入167 μl牛皮I型胶原蛋白溶液（终浓度为1 mg/ml）。</li>
	<li>充分混匀溶液，然后将80 μl该溶液移入硅烷化玻璃底培养皿的玻璃区域。</li>
	<li>将培养皿放入培养箱中，在37 °C下孵育30分钟，使凝胶聚合。典型的p35玻璃底培养皿中的胶原凝胶参见图1A。</li>
	<li>向每个培养皿中小心加入2 ml生长培养基。</li>
</ol>
4. 时间序列图像采集步骤
<ol>
	<li>打开显微镜 enclosure 的温度控制，使显微镜腔室平衡至稳定的 37 °C。</li>
	<li>更换培养基为含有 25 mM Hepes 的新鲜培养基，以维持中性 pH。对于微分干涉差（DIC）成像，更换培养皿顶部为玻璃底的盖子。使用一小条 Parafilm 覆盖培养皿边缘，防止培养基蒸发。</li>
	<li>对于油浸物镜，在物镜上滴加一滴浸油。</li>
	<li>将含有胶原凝胶的培养皿放置在显微镜载物台上，并确保培养皿与浸油接触。</li>
	<li>对样品进行调焦，并寻找需要成像的目标细胞。为尽量减少载物台漂移，在开始长时间采集前，让培养皿静置约 45 分钟。</li>
	<li>设定图像采集参数。通过调节激光功率、曝光时间、采集频率和持续时间，尽量减少激光暴露，以避免对细胞造成损伤。具体参数将根据显微镜系统和细胞类型的不同而有所变化。</li>
	<li>在延时成像过程中，可加入抑制剂。对于抑制剂添加实验，不要用 Parafilm 密封培养皿。
	<ol>
		<li>准备含有药物且浓度为所需工作浓度的 Hepes 补充培养基。</li>
		<li>当准备向培养基中添加药物时，暂停图像采集，并小心取下培养皿盖子，避免扰动培养皿。</li>
		<li>吸出培养皿中的培养基，用移液器将含药物的培养基加入培养皿中，然后小心地放回培养皿盖子。</li>
		<li>由于加入新的培养基可能导致样品失焦，需重新调整焦距。</li>
		<li>重新开始图像采集，随后监测 30 分钟，并根据需要重新调整焦距。图 4 展示了药物添加实验的一个示例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. FRAP 实验步骤与分析
<ol>
	<li>FRAP 装置因系统而异，请遵循制造商的说明。</li>
	<li>设置活细胞成像的参数。</li>
	<li>设置光漂白参数。使用足够的激光功率对荧光信号进行光漂白，同时避免损伤细胞。在练习用细胞上测试这些参数。</li>
	<li>开始图像采集，并在对目标区域进行光漂白前至少采集 5 帧图像。</li>
	<li>继续采集图像，恢复时间应足够长以捕获完整的荧光恢复过程。FRAP 实验示例见图 5。</li>
	<li>通过测量光漂白区域（光漂白前后）随时间变化的平均荧光强度来分析荧光恢复情况。使用统计分析软件（例如 Excel），将恢复曲线拟合到指数方程：I=If(1-e-kt)，其中 I 为强度，If 为最终强度，t 为时间，τ½ 为强度达到最终值一半所需的时间：τ½=ln(2)/k。半衰期是蛋白质移动速率的衡量指标。</li>
	<li>从指数拟合曲线中获取半衰期和最终强度参数。通过计算最终荧光强度与初始荧光强度的比值，求得可移动组分比例。</li>
</ol>
6. 代表性结果
图3展示了基质内健康上皮细胞的活细胞成像示例。健康细胞具有光滑、连续的细胞膜以及清晰的细胞核，而不健康细胞则常表现出细胞膜破裂以及大量空泡。在三维基质中，单个上皮细胞会发生迁移1，经过数天后，上皮细胞在基质内形成三维球形的多细胞囊泡结构2。这些细胞还表现出高度动态性，并可在囊泡内部迁移（图3）。通过分析嵌入周围基质中的示踪颗粒的位移，可研究迁移细胞施加的牵引力所导致的基质形变（图4）。示踪颗粒的运动以不同时相点的最大投影图像显示，每个时间点采用伪彩着色以表示时间进程（图4B）。或者，单个示踪颗粒的图像可排列为图像拼接图，以展示其随时间的运动轨迹（图4C）。所有图像分析均使用ImageJ软件完成。这些对基质形变以及迁移细胞所施加力的定性评估，可作为牵引力分布的初步近似判断。对三维环境中迁移细胞所施加牵引力的定量估算不在本实验方案的范围之内，相关方法已在其他文献中描述3,4。
图5展示了一个典型的光漂白后荧光恢复实验。必须使用优化的激光设置对感兴趣区域进行光漂白，使荧光强度明显低于背景水平（以最大化信噪比），同时保持细胞处于健康且未受损的状态。最佳设置需通过实验确定，因为每种FRAP装置都不同（例如，使用激光扫描共聚焦系统的FRAP）。
必须严格控制 FRAP 后图像采集的曝光时间和时间间隔，以避免背景光漂白。使用较低的激光功率、较短的曝光时间，以及高灵敏度相机和高效率光学系统，对于获得高质量的 FRAP 成像至关重要。如果在图像采集过程中发生显著的荧光漂白，则必须对这种背景信号衰减进行量化，并从观测到的荧光强度恢复中予以归一化校正。由于环境具有三维特性，荧光强度恢复的 z 轴分量可能变得显著。因此，有必要通过采集光漂白区域在漂白前后的三维层扫图像，来明确定义光漂白体积。有关荧光恢复的进一步分析与建模已在其他文献中讨论5,6。
活细胞成像技术的独特组合：利用GFP追踪细胞骨架蛋白的动态变化、红色荧光示踪颗粒监测基质形变，以及添加抑制剂，可同时用于分析蛋白动态、牵引力和分子通路。
<img alt="胶原蛋白包被过程示意图；用于细胞培养实验的盖玻片表面化学修饰。" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 胶原凝胶的制备。A) 玻璃底培养皿上聚合的胶原蛋白基质。凝胶呈粉红色是由于其中嵌入了荧光微粒。B) 处理玻璃底培养皿以将胶原凝胶交联至玻璃表面的操作流程。首先用3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液处理玻璃底培养皿，随后使用戊二醛溶液，使胶原基质与玻璃表面发生交联。
<img alt="荧光显微镜示意图，包含FRAP装置、激光发射和样品分析光学系统。" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 共聚焦/FRAP显微镜装置示意图。该共聚焦显微镜基于Zeiss AxioObserver构建，配备CoolSnap HQ II CCD相机，并由Slidebook软件（Intelligent Imaging Innovations）实现完全自动化控制。共聚焦单元为定制设计，基于Yokogawa旋转盘单元CSU10，配备两台固态激光器（488 nm，50 mW；561 nm，40 mW），并通过声光可调滤波器（AOTF）实现毫秒级双激光切换。发射滤光片分别为525/50 nm和620/60 nm（#118661和#118085，Chroma Technology），二向色镜为488-568 BrightLine双通带滤光片（Semrock）。物镜包括一支长工作距离40倍C-Apochromat物镜（数值孔径NA为1.1，工作距离0.62 mm）和一支63倍Plan-Apochromat物镜（NA为1.4，工作距离0.19 mm）。显微镜还配备FRAP光漂白系统，该系统由光纤泵浦染料激光器、计算机控制的光束位置与强度调节装置以及衍射极限聚焦光斑组成。此外，显微镜配有x-y轴电动载物台，每个轴均装有0.1微米线性编码器。在延时成像过程中，环境温度通过定制设计的显微镜培养室及带反馈温控的加热装置维持恒定。为隔绝任何噪声和振动，整个显微镜系统置于无振动光学平台上。
<img alt="延时显微镜、细胞分裂阶段、荧光、动态分析、科学观察。" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 表达GFP-肌动蛋白的上皮细胞的活细胞成像。这些细胞在三维胶原基质中培养4天后形成囊肿。部分细胞沿囊肿表面移动（黄色箭头），而另一些细胞则在囊肿内部迁移（红色箭头）。比例尺为10 μm，时间为小时。
<img alt="显微镜图像中的细胞分裂过程；荧光标记；使用 Y27632 的实验设置。" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. Rho 激酶抑制对牵引力的影响。A) 表达 GFP 标记核标记物的迁移性 MDCK 细胞的 DIC 图像。图像拍摄于添加 Rho 激酶抑制剂 Y-27632 之前即刻。比例尺为 10 μm。B) 添加 Y-27632 后引起的微粒位移。不同时间点（0 - 52 分钟）的微粒位置根据强度标尺进行伪彩色编码，然后投影到单幅图像上。白色区域为迁移细胞中 GFP 阳性的细胞核。比例尺为 10 μm。时间为分钟。C) 细胞尾部边缘的微粒运动（见 B 图中的箭头）。星号表示添加 Y-27632 前捕获的最后一帧图像。在添加 Y-27632 前后，示踪微粒分别朝向和远离迁移细胞的尾部边缘移动。比例尺为 1 μm。
<img alt="随时间显示荧光研究中光漂白过程的连续脑成像及强度图。" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 在三维基质中迁移的表达GFP-肌动蛋白细胞的荧光漂白后恢复（FRAP）分析。A) 表达GFP-肌动蛋白的细胞在光漂白前后的时间序列图像。在时间点0时，细胞后端积累的GFP-肌动蛋白局部区域被光漂白（红色箭头所示）。时间为秒，比例尺为5 μm。B) 光漂白区域的平均荧光强度（实线）以及荧光恢复的指数拟合（圆圈）随时间的变化曲线。荧光强度已相对于光漂白前的初始值进行归一化处理。

<ol><li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li>
<li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li>
<li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍了一种利用活细胞成像技术在三维基质中研究细胞迁移机制的方法。该技术的成功依赖于获得稳定表达GFP标记蛋白的“优质”克隆。GFP蛋白表达水平过低将需要过强的激发光照射，从而影响细胞健康；而表达水平过高则会对细胞产生不良的副作用。因此，选择合适的载体将基因转染至细胞中至关重要（例如启动子、荧光标签等）。除GFP外，还有多种其他荧光标签可供选择，包括红色荧光蛋白（RFP）7,8。这些蛋白标签需要特定波长的激发光，因此需使用不同的荧光滤光片组合。此外，还可利用不同的抗生素抗性基因（如G418、潮霉素、嘌呤霉素等）筛选并建立稳定表达的克隆。
对于活细胞成像，也可使用瞬时转染的细胞。尽管这种方法可最大限度减少建立稳定细胞系所需的时间和工作量，但瞬时转染的细胞通常状态不佳，因此在实验中的可靠性较低。此外，瞬时转染细胞群体是由表达与非表达细胞组成的异质性混合物，且表达细胞会随着时间推移逐渐丧失荧光蛋白的表达。相比之下，稳定表达细胞通常由单个细胞克隆扩增而来，其蛋白表达应保持稳定且均一，尽管表达水平通常低于瞬时表达细胞。由于稳定细胞克隆很可能起源于单个细胞，因此在筛选...

<table><tbody><tr><td>胶原蛋白，牛源，I型</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>储存浓度约为 3 mg/ml</td></tr><tr><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>用水稀释</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td>用PBS稀释</td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fluospheres 聚苯乙烯微球 1 &amp;mu;m，红色荧光 (580/605)</td><td>Invitrogen</td><td>F13083</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素（G418）</td><td>Invitrogen</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S115500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15160-054</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

传统上，细胞迁移是在二维的刚性塑料表面进行研究的。然而，在伤口愈合、组织再生和癌症转移等重要的生物学过程中，细胞必须穿行于复杂、三维的细胞外组织中。为了更深入地理解这些生物学过程背后的机制，研究驱动细胞迁移的相关蛋白质的作用至关重要。本文介绍了一种利用上皮细胞系（MDCK）和一种三维纤维状自聚合基质作为模型系统来研究细胞迁移机制的实验方案。这种光学透明的细胞外基质易于进行活细胞成像研究，且能更好地模拟生理条件下的柔软组织环境。本报告展示了一种直接可视化蛋白质定位与动态变化以及周围三维基质形变的技术。
在细胞过程中研究蛋白质的定位与动态变化，可为理解蛋白质功能提供关键信息。基因编码的荧光标签为观察蛋白质定位和动态提供了一种独特的方法。利用该技术，我们能够实时分析细胞在基质中移动时，关键的、产生力学作用的细胞骨架组分在亚细胞结构中的聚集情况。此外，通过使用不同波长的多种荧光标签，我们可以同时检测多种蛋白质的定位，从而能够检验例如不同蛋白质是否具有相似或不同的功能。进一步地，荧光标记蛋白质的动态行为可通过光漂白后荧光恢复（FRAP）分析进行定量。该检测方法可评估蛋白质的移动性及其与细胞骨架网络结合的稳定性。
通过将活细胞成像与蛋白质功能抑制剂处理相结合，我们可以实时观察迁移细胞中蛋白质分布和细胞形态的变化。此外，我们还将活细胞成像与嵌入基质中的荧光示踪颗粒相结合，以可视化细胞迁移过程中基质的形变。因此，我们可以观察到迁移细胞如何分布产生力的蛋白质，以及牵引力施加于周围基质的位置。通过这些技术，我们能够深入了解特定蛋白质的作用及其在细胞迁移机制中的贡献。

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。

传统上，细胞迁移是在二维的刚性塑料表面进行研究的。然而，在诸如伤口愈合等重要的生物学过程中……

本演示旨在对三维基质中活细胞内的荧光标记蛋白进行成像。首先，构建表达荧光标记蛋白的稳定细胞系。将这些细胞接种至三维胶原基质中，然后使用共聚焦显微镜采集迁移细胞的时间序列图像。最终，通过延时成像和荧光蛋白分析，研究结果揭示了迁移细胞内蛋白质的定位与动态行为，实现了在三维环境中实时观察蛋白质的动态变化和定位。该方法为解答细胞迁移领域的基本科学问题提供了一条途径。例如，胞质蛋白如何调控黏着接触？此外，这些相互作用如何受到特异性抑制剂的影响？在35 mm培养皿中培养细胞，当细胞融合度达到80%至90%时，按照生产商说明书，使用Lipo 2000将目的质粒转染至细胞中。随后将细胞放入培养箱中孵育。第二天，将细胞分种到两个 P150 培养皿中，过夜培养。补充培养基，加入终浓度为 50 微克/毫升的 G418。在抗生素筛选条件下继续培养两周。检查培养物中G四18抗性菌落，然后使用倒置荧光显微镜识别并标记GFP阳性菌落。用 PBS 清洗细胞两次。第二次清洗后，保留一层薄液以防止每个标记的克隆干燥。用无菌棉签尽可能贴近边缘擦拭，并用移液器将 10 微升胰蛋白酶滴加到克隆上。对每个菌落迅速重复上述操作。然后将培养皿置于37摄氏度下孵育，以使细胞脱落。在显微镜下观察，确认细胞呈圆形。向每个克隆中加入10 µL胰蛋白酶，用移液器吹打使细胞完全从培养板上脱离。然后将每个克隆的细胞转移至24孔板中的单个孔内进行培养，以扩增稳定克隆。接着，使用标准的蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光方法检测克隆的蛋白表达情况。扩增选定的细胞系，对玻璃表面进行修饰。底部培养皿可实现最佳的胶原蛋白结合。用移液器将300微升硅烷化溶液滴加到每个直径10毫米开口的P 35培养皿的玻璃部分。室温孵育1小时。吸除溶液，用滤水洗涤3次，每次10分钟。去除水后，将培养皿置于50 °C的加热板上1.5小时。将培养皿盖稍错开培养皿放置，以利于干燥。待培养皿干燥并冷却后，用移液器向每个培养皿的玻璃部分加入 300 µL 的 2% 戊二醛溶液。孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。将培养皿暴露于紫外光下照射一小时，进行灭菌。首先，取100 µL荧光示踪颗粒，通过离心形成沉淀。弃去上清液，将颗粒重悬于500 µL培养基中。进行五次洗涤，然后将颗粒重悬于30 µL培养基中。接着，用胰蛋白酶消化收获表达GFP的细胞，并将细胞重悬于离心管中，浓度为每毫升200万个细胞。用移液器加入240 µL生长培养基。依次加入12.6 µL 1摩尔HEPES溶液、20 µL过滤水、50 µL细胞悬液和10 µL荧光颗粒。最后，加入 167 微升牛皮胶原蛋白溶液，充分混匀。然后将 80 微升混合液转移至已硅烷化处理的培养皿的玻璃部分。在 37 摄氏度下孵育 50 分钟，使凝胶聚合。然后小心加入两毫升培养基。将显微镜培养室平衡至37摄氏度的稳定温度，并更换细胞培养液。为了在微分干涉差（DIC）成像过程中维持中性pH值，将培养皿的顶部更换为带有薄条状对二氯苯的玻璃盖。用盖子覆盖培养皿侧面，以防止油浸物镜使用时液体蒸发。在物镜位置滴加一滴浸油。将含有胶原凝胶的培养皿置于显微镜载物台上，使培养皿与浸油液体接触。聚焦样本并寻找需要成像的目标细胞，以尽量减少载物台漂移。让培养皿静置约45分钟。在开始长时间采集前，确定抑制剂添加实验的图像采集参数。配制含有药物且达到所需工作浓度的完全培养基。更换细胞培养基以维持中性pH值，但不要用封口膜密封。将样品转移至显微镜，并在给药处理的同时开始成像。暂停图像，捕获并小心取下培养皿盖，注意不要扰动培养皿。吸出培养基，用移液管将含药物的培养基加入培养皿中。然后小心地将培养皿放回原位。不同的系统中，FRAP 顶部设置各不相同，因此请参考制造商的说明书。首先为活细胞成像设置参数。进行光漂白时，先在练习用细胞上测试这些参数，以获得足够的激光功率，在不损伤细胞的情况下漂白荧光信号。随后，开始对样品进行图像采集，至少获取五帧图像。然后对目标区域进行光漂白。持续采集恢复时间内的图像。使用统计分析软件，随时间测量光漂白区域在光漂白前后平均荧光强度的变化。将恢复曲线拟合到指数方程。从指数拟合曲线中获得半衰期和最终荧光强度的参数。然后通过最终荧光强度与初始荧光强度的比值计算可移动组分的比例。这些三维活细胞图像显示了表达GFP肌动蛋白的健康上皮细胞。经过四天的培养，这些细胞在三维胶原基质中形成了一个囊肿。部分细胞沿囊肿表面迁移，而另一些细胞则在囊肿内部迁移。迁移细胞施加的牵引力会导致基质发生形变，通过分析嵌入周围基质中的示踪颗粒的位移，可对这种形变进行研究。此处展示了RO激酶抑制对牵引力的影响。示踪颗粒的运动以不同时相点的最大投影图像显示，每个时间点均采用伪彩着色。或者，单个示踪粒子的图像以拼接图形式显示，以展示该示踪粒子的运动轨迹。随着时间推移，在分别添加 Y 2 7 6 3 2 之前和之后，该示踪粒子先后靠近并远离迁移细胞的尾缘。FRAP 分析用于追踪表达 GFP-肌动蛋白的细胞在三维基质中迁移的过程，显示典型的光漂白后荧光恢复现象。在优化的激光设置下进行光漂白实验后，目标区域的荧光强度相较于背景水平明显降低，同时保持细胞健康且未受损伤。该图显示了恢复曲线与指数函数的拟合情况。掌握该技术后，将细胞接种到基质中大约需要一小时。切勿忘记，使用三氨基丙基三甲基可能具有极高危险性。因此，请采取预防措施，例如在通风橱中操作。同时，在三维基质中处理细胞时，务必保持无菌条件。

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