Name: אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למד אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים מתאי דם היקפיים באמצעות תאי CD34 חיוביים וזיהום ויראלי. השיטה מאפשרת הפקת נוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים לחקר מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

<ol><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941(2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroblast+assay%3A+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Huntington%27s+Disease+Cell+Model+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSCurr%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lee, S. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Generation+of+Neurosphere-Like+Cells+from+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts.</a> PLoS ONE. 6, e21801(2011).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34%2B+cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720(2013).</li>
<li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li>
</ol>

המחקר ממומן על ידי קרנות פנימיות של ה-NIH.

פרוטוקול מפורט ליצירת תאי גזע עצביים ישירות מתאי hematopoietic היקפיים מסופק. בהשוואה לתאים פיברובלסטים, דם היקפי אדם הוא נגיש יותר. תוך שימוש בפרוטוקול שהוצג, יותר מ 1 x 10 5 תאי דם, או תאים חיוביים CD34, יכול להיות מועשר מ 10 מיליליטר של דם מלא. למרות זיהום עם טסיות דם הוא בדרך כלל לא ניתנים למניעה, זה יכול להיות מופחת בקלות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וזה לא מפריע לדור בתאי גזע עצבי. עם זאת, האיכ...

במבחנה תרבויות עצביות כבר בשימוש ככלי בסיסי ללימודים של מחלות נוירולוגיות. בעלי החיים עיקריים (בעיקר מכרסמים) תרבויות עצביות 1, 2 ושורות תאים עצביות בבני אדם מתוך גליומות או גידולים אחרים הם שימוש נפוץ ביותר במחקרים מסוג זה. עם זאת, זה כבר הכיר בכך שיש הבדלים משמעותיים בין מכרסמים ותאים אנושיים. ממצאים רבים המבוססים על מכרסמים לא יכולים להיות מתורגמים לבני אדם. יתר על כן, עם ההתפתחויות מהירות בניתוח מידע גנומי המוני ועריכת גן קלה יחסית ורצף הגנום כולו, המגמה היא יותר ומכוון יותר לגילוי גנים נוטים מחלה והתוויית הפונקציות ותפקידיהם במחלות ספציפיות, מה שהופך את עצבי האנושיים כמה שורות תאים שרק מוגבלות שימוש. באופן תיאורטי, תרבויות עצביות עיקריות בבני אדם מתוך דגימות של מערכת עצבים מטופל הן הבחירה הטובה ביותר, אבל הם בלתי אפשריים להשיג; ספיד מכאן חלופיods נחוץ. בשנים האחרונות, כמה גישות כבר רדפו, עם שני להיות המובחנים ביותר. בעקבות הפיתוח של הטכניקה של תאים לייצר מושרה pluripotent גזע (iPSC) עכבר באמצעות תאים סומטיים ואדם 3, 4, תאים עצביים יכולים להיות מובחנים נוסף מהם 5-7. עם זאת, יצירה ואפיון iPSC דורשת עבודה אינטנסיבית, טכניקות, וקלט זמן, לפעמים אפילו להחריד. זמן קצר לאחר, גישה אחרת פותחה כדי להפוך ישירות תאים עצביים מהתאים סומטיים 8, 9. כתאי עצב וכתוצאה מכך הם אינם שגשוג, הוא מגביל היישום שלה בלימודים אינטנסיביים והקרנת סמים, אשר דורשת כמות גדולה של תאים. לקחת את היתרונות של שני השיטות, הגזירה ישירה של גזע עצבי / תאי אב מהתאים סומטיים נחקרו על ידי מספר קבוצות 10-12, שעוקפת את התהליך מייגע של דור iPSC ואפיון אבל עדיין provides מספר מכובד של תאי גזע עצביים לבידול עצבי מאוחר יותר. הראינו בעבר כי בעקבות כניסתה של גורמי שעתוק יאמאנאקה לתאי דם, תאי גזע עצביים יכולים להיות שנוצרו ישירות באמצעות תא עצבי בחירה בינונית 13. כאן, אנו מדווחים על השיטה בפירוט.

<table><tbody><tr><td>מדיום הפרדת לימפוציטים</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום אנושי</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr> <tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS טור</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM בינוני</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>איכות ביולוגית</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני</td> <td>CryoTubeתרמו</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>מיכל מר פרוסטי</td><td>תרמו</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A2934</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC סרום ללא מדיום</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין/למינין מצופה תלושי כיסוי BD</td><td>Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>ויטמין C</td><td>סיגמא</td><td>A0278</td><td>0.2 מ"מ</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>פפרוטק</td><td>450-02</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>פפרוטק</td><td>450-10</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>פפרוטק</td><td>100-13A</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>פפרוטק</td><td>450-03</td><td>2 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>ש"ש</td><td>פפרוטק</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 ננומטר</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>איכות ביולוגית</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr> <tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 נוגדן</td><td>תאי גזע מיושמים</td><td>ASA0120</td><td>מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>עכבר אנטי ובטא; III-tubulin נוגדן</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFAP נוגדן</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-O4 נוגדן</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן נגד ארנב עיזים</td> Life <td>techniologies</td><td>A11012</td><td>1:400 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן נגד עכברים עיזים</td><td>טכניקות חיים</td><td>A11001</td><td>1:400 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר נוגדן IgM</td><td>Life techniologies</td><td>A21042</td><td>1:250 דילול</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; גרם/מ"ל</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי hematopoietic אב

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

תרבויות עצביות ספציפיות מחלות של בני אדם הן חיוניות ליצירת מודלים במבחנה למחלות נוירולוגיות אנושיות. עם זאת, היעדר הגישה לתרבויות עצביות מבוגר אנושי ראשוניות מעלה אתגרים ייחודיים. ההתפתחויות האחרונות בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מספקת גישה חלופית לנובעות תרבויות עצביות מfibroblasts העור באמצעות iPSC הספציפי מטופל, אך תהליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, דורש מומחיות מיוחדת וכמויות גדולות של משאבים, ויכולות לקחת כמה חודשים. זה מונע את היישום הרחב של טכנולוגיה זו לחקר מחלות נוירולוגיות. כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, פיתחנו שיטה להפקת תאי גזע עצביים ישירות מהדם היקפי מבוגר אנושי, תוך עקיפת תהליך גזירת iPSC. תאי אבות היווצרות הדם מועשרים מהדם היקפי אדם הבוגר היו בתרבית במבחנה וtransfected עם וקטורי וירוס סנדאי המכילים Sox2 גורמי תעתיק, אוקטובר3/4, Klf4, ו- c-Myc. תוצאות transfection בשינויים מורפולוגיים בתאים שנבחרו עוד יותר על ידי שימוש במדיום עצבי אנושי המכיל גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF) וכלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). התאים וכתוצאה מכך מאופיינים בביטוי לסמנים של תאי גזע עצביים, כגון nestin וSox2. תאי גזע העצביים אלה יכולים להיות מובחנים נוספים לתאי עצב, astroglia וoligodendrocytes בתקשורת בידול שצוינה. שימוש בדגימות דם נגיש אנושיות היקפית, שיטה זו יכולה לשמש כדי להפיק תאי גזע עצביים להבחנה נוספת לתאים עצביים לדוגמנות במבחנה של הפרעות נוירולוגיות ועשויה לקדם מחקרים הקשורים להיווצרות המחלה והטיפול במחלות אלה.

<html> האיכות של תאי CD34 היא קריטית להצלחה של התמרה של תאי גזע עצבי. תאי CD34 באיכות גבוהה להתרבות במהלך כמה ימים של התרבות הראשונה ומופיעים כחסיד עישון, תאים עגולים homogenously, צפים מעל התחתית של כלי תרבות (איור 1 א). תוצאות הזיהום המוצלחות באגרגטים תא, אשר מרחיב לאורך הזמן (איור 1), ואילו אגרגטים תא ספציפיים שאינם עלולים להתרחש במהלך תרבית תאים, המרחיבים ועמותות רופפות. תאים חסיד מופיעים בדרך כלל סביב שלושה עד חמישה ימים לאחר transfection; הם ...

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא השראה ישירה של תאי גזע עצביים מתאי דם. דבר זה מושג תחילה על ידי העשרה של תאי אב המטופואטיים חיוביים ל-CD 34 מהדם. השלב השני הוא טרנספקציה של תאי CD 34 באמצעות נגיף sendi המכיל פקטורים שעתוקיים.בשלב הבא, גוזרים את תאי הגזע העצביים באמצעות מצע סלקטיבי. השלב האחרון הוא גזירת תאי הגזע העצביים המודחים לנוירונים, אסטרוגליה ואוליגודנדרוציטים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי לאפיין את התאים שהתקבלו.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גזירה של נוירונים ישירות מפיברובלסטים או יצירת IPS, הוא ששיטה זו עוקפת את התהליך המייגע של יצירת וחישוב IPS, אך עדיין מספקת כמות גדולה של תאים נוירונליים שיכולים להתרבות ולהתמיין לנוירונים. הרעיון לשיטה זו עלה במוחי לראשונה כאשר שמתי לב שתאי CT 34 שעברו טרנספקציה ונצמדו למצע נראים למעשה דומים מאוד לתאי פרו-גניק נוירונליים בתרבית ראשונית, מה שמעיד על כך שההליך יעבוד. לאחר בידוד תאי CD 34 מתאי מונונוקלאריים של דם פריפריאלי בהתאם להוראות בפרוטוקול הטקסט, התחילו בתהליך תרביות תאי ה-CD 34 על ידי רסוסיפנזיה, השהיית תאי ה-CD 34 במצע CD 34, ולאחר מכן זריעת התאים בלוח 24 בארות בריכוז של 3 × 10⁵ תאים לבארה ב-1 mL של מצע.לאחר דגירה למשך 24 שעות באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide, אספו את התאים הצפים וסובבו את תגלי התאים בcentrifuge במהירות של 110 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את העלייה (supernatant) ותלו את התאים מחדש במצע תחזוקה רענן של CD 34. זרעו בלוח 24 בארות חדש בריכוז של 1 × 10⁵ תאים לבערה ב-1 mL של מצע, דגרו בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide למשך חמישה ימים נוספים, תוך החלפת מחצית מהמצע מדי יומיים.יש לשאוב בזהירות את החצי העליון של העל-נוזל בעוד תאי ה-CD 34 נמצאים בתחתית הבארות, כפי שמוצג כאן ביום החמישי. לאחר הזריעה, אספו את תאי ה-CD 34 וסובבו אותם בצנטריפוגה ב-170 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את העל-נוזל, השהו שוב את התאים כפי שנעשה קודם לכן וזרועו פלטת 24 בארות חדשה בריכוז של 1 × 10⁵ תאים לבארה ב-1 mL של מצע גידול. לאחר מכן, הפשיתו ערכה להסבה של IPS מסוג CytoTune.ראשית, טבלו את תחתית המבחנות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 שניות, ולאחר מכן הפשיתו אותן לחלוטין בטמפרטורת החדר. סובבו את המבחנות קצרה בצנטריפוגה והניחו אותן על קרח. הכינו את תערובת נגיף Sendai על ידי ערבוב הנפח המומלץ של כל נגיף המפורט בתעודת האנליזה עבור האצווה המתאימה.מומלץ להשתמש בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של 15. הוסף את תערובת נגיף Sendai לכל באער המכיל תאי CD 34. לאחר מכן, ערבב את הבאערים על ידי ניעור עדין של הפלטה.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות. בחנו את יעילות הטרנסדוקציה. שימו לב כי אגרגטים של תאים וספרואידים, כפי שמוצגים כאן, מהווים אינדיקציה לטרנסדוקציה מוצלחת.לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור לתרביות רקמה למשך חמישה עד שבעה ימים, עד להופעת תאים נצמדים והגעה ל-30 עד 50% confluence, כפי שמוצג כאן, בבדיקה מדי יומיים. החליפו מחצית מהמצע על ידי העברה זהירה של החלק העליון של המצע לבאר אחרת. אם ספרונים של תאים (cell spheres) הועברו לבאר החדשה, הוסיפו כמות שווה של מצע טרי.בדקו את רמת ההצפיפות (confluency) של התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. כאשר התאים מגיעים ל-30 עד 50% הצפיפות, שאבו את העלייה (supernatant) ושמרו אותה, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול לתאי אב עצביים (neural progenitor medium) לכל באר כדי להכין פלטת גיבוי. צנטריפוגו את העלייה השמורה במהירות של 170 ×g למשך 10 דקות כדי להפיק ספירות מהעלייה. לאחר מכן, שאבו את העלייה ושעשעו מחדש את המשקע (pellet) במצע גידול לתאי אב עצביים, והעבירו לפלטת 24 בארות מצופה במטריג'ל (matrigel).כפי שנעשה קודם לכן, החליפו את המצע בכל צלחת של תאים מדי יומיים, עד שהתאים יגיעו ל-60 עד 80% confluence. בדרך כלל זה קורה לאחר שבוע. ברגע שהתאים מגיעים ל-confluence הנדרש, שאבו את העליון (supernatant) והוסיפו מיליליטר אחד של מצע לתאי גזע עצביים לכל צלחת.כעת הפרד את התאים באמצעות גורד תאים (cell scraper), ולאחר מכן בצע פיפטינג עדין מאוד. לאחר מכן, העבר את התאים מבאר אחת בלוחית 24 הבארות לבאר אחת בלוחית של שש בארות.הוסיפו מיליליטר נוסף של מצע לבאר, ולאחר חזרה על הפרוצדורה עבור כל הבארים, הכניסו את פלטת שש הבארים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. החליפו את כל נפח המצע מדי יומיים עד שהתאים יגיעו ל-60% confluence, ולאחר מכן בצעו דיסוציאציה והזרעה מחדש של התאים ביחס של one to three כפי שהודגם זה עתה, כדי להקפיא חלק מתאי הגזע העצביים הבלתי מובחנים. ראשית, הכינו את מצע ההקפאה של תאי הגזע על ידי הוספת 20% dimethyl sulf oxide או DMSO למצע תאי הגזע העצביים והניחו על קרח.לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה לתאים בלוח שש הבארות, באמצעות גורד תאים (cell scraper) ופיפוט עדין. השאירו מנה (aliquot) מהסספנסיה לספירת תאים, ולאחר מכן סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-170 $\times$g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בזמן סיבוב התאים, ספרו את התאים במנת הסספנסיה באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי, וחשבו את נפח המדיום הדרוש כדי להגיע לריכוז תאים של $1 \times 10^6$ תאים למילליליטר.לאחר סיום הסבוב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) במצע גידול לתאי גזע עצביים בריכוז של 1×10⁶ תאים למוליליטר. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של מצע הקפאה, העבירו בעזרת פיפטה 5×10⁵ תאים בנפח של 1 מיליליטר למבחנה לקריוגנניקה (cryo vial), והקפיאו את התאים במכל הקפאה בהתאם להוראות היצרן. כאשר תאי הגזע העצביים בפלטה בעלת 6 בארות מגיעים ל-80% התמזגות (confluence), הפרידו אותם באמצעות מגרד גומי (rubber policeman) ולאחר מכן בצעו דיסוציאציה על ידי פיפטינג עדין.העבירו את תרחיף התאים למבחנה סטרילית. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי והתאימו את ריכוז תרחיף התאים ל-1×10⁵ תאים למילליליטר באמצעות מצע גידול לתאי גזע עצביים. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 1 ml של תרחיף התאים על עלית זכוכית מצופה ב-poly D lysine ולמינאט בתוך באער אחת של פלטת 24 באערים, וחזרו על הפעולה עבור מספר הבאערים הרצוי.דגרו כבעבר למשך 24 שעות. לאחר תום זמן הדגירה, שאבו את המצע והחליפו אותו במצע בידול עצבי. דגרו למשך שבועיים ב-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide, תוך החלפת המצע פעמיים בשבוע. לאחר שבועיים.התאי הגזע העצביים צריכים להיות מובחנים באופן מלא כפי שמוצג כאן ומוכנים ליישומים המשכיים כגון צביעה באימונופלואורסצנציה. שתי התמונות הראשונות מראות כי תאי גזע עצביים מבטאים nestin ו-SOX2. בעוד שהתמונה השלישית מדגימה כי OCT4 אינו מבטא, DPI משמש כסמן גרעיני וסרגל המقياس מייצג 200 microns.לאחר ביצוע פרוטוקול ההבחנה המתואר בסרטון, הנוירונים המובחנים מביעים את הסמן הנוירונלי beta three tubulin. ניתן להבחין תאי גזע עצביים אנושיים גם לתאי גליאה. כאשר הם מובחנים לאסטרוציטים, התאים מביעים את הסמן האסטרוציטי GFAP.לבסוף, בתמונה זו, התאים הובחנו לאוליגודנדרוציטים ומבטאים את הסמן לאוליגודנדרוציטים O4. לאחר השליטה בתהליך, ניתן לבצע ייצור של תאי גזע עצביים אנושיים מושריים מדם פריפריאלי תוך כשלשה שבועות.אם יבוצעו כראוי, תאי הגזע העצביים יוכלו לעבור דיפרנציאציה נוספת לנוירונים; השיטה שבה הדבר מתבצע היא חלופה לתהליכי יצירת IPS ארוכים ומסובכים, ועשויה להוות אפשרות פשוטה ליצירת תרביות נוירונליות ספציפיות למטופל לאחר פיתוחה. נתיב טכני זה מאפשר לחוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור מודלים של תרביות תאים אינדיבידואליות עבור הפרעות נוירולוגיות שונות, שעשויות לייצג טוב יותר את ההבדלים הגנטיים בהפרעות ספציפיות, במיוחד מדגימות של מטופלים בודדים.

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

סרטון זה מדגים תכנות מחדש של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs) לתאי גזע עצביים מושרים (iNSCs) באמצעות וירוס סנדאי. וירוס סנדאי הוא וירוס שאינו משלב ומציע כלי יעיל ובטוח לתכנות מחדש של תאים.

יצירת תאי גזע עצביים מושרים (iNSCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs): הליך מבוסס וירוס סנדאי לתכנות מחדש של PBMNCs לתאי גזע מושרים

סרטון זה מדגים תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים מהונדסים גנטית לתאי גזע עצביים. גורמי שעתוק המבוטאים על ידי תאי אב המטופויטיים מעוררים שרשרת של אירועים מולקולריים המאפשרים את טרנספורמציה. מדיה ספציפית נוספת משמשת לבחירה ולגידול של תאי גזע עצביים מושרים.

תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים לתאי גזע עצביים

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

אנו מציעים פרוטוקול לתכנות מחדש של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). על ידי ציפוי תאי הדם המומרים על צלחות מצופות מטריצה עם צנטריפוגה, iPSCs מושרים בהצלחה מתאים צפים. טכניקה זו מציעה פרוטוקול תכנות מחדש פשוט ויעיל עבור תאים כגון PBMCs ו-CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

למד אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים מתאי דם היקפיים באמצעות תאי CD34 חיוביים וזיהום ויראלי. השיטה מאפשרת הפקת נוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים לחקר מחלות נוירולוגיות.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

גלה סרטונים נוספים