Name: 单细胞悬液的细胞荧光分析从不同的鼠标皮肤区域准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习从小鼠皮肤不同区域制备单细胞悬液并进行流式细胞术分析的方法，用于识别驻留免疫细胞群体。该技术可完整保留细胞表面标志物，适用于免疫学和细胞生物学研究。

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本工作得到了意大利癌症研究协会（AIRC，IG14593，MFAG13235）、Cariplo基金会（资助编号2010-0678和NANOVAC）以及伦巴第地区生物医学研究基金会的资助。

研究批准：实验方案已根据1992年1月27日第116号立法法令《实施关于用于实验或其他科学目的动物保护的第86/609/EEC指令》，获得意大利卫生部（意大利罗马）批准&#34;Attuazione della Direttiva n. 86/609/CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici.&#34;
1. 获取皮肤样本
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>耳朵：
	<ol>
		<li>剪下小鼠耳部无毛的部分。</li>
		<li>用镊子将耳部的背侧与腹侧分离。用镊子轻轻刮除耳内侧残留的软骨组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>躯干皮肤：
	<ol>
		<li>使用电动剃刀和温和的脱毛乳液对动物全身皮肤进行剃毛处理。</li>
		<li>切下所需皮肤样本（从 2 cm2 至整张动物皮肤）。
		<ol>
			<li>若切除整个小鼠背侧和腹侧皮肤，先在小鼠背部中央做一纵向切口，然后沿小鼠身体周围剃毛区域的边界进行剪切。</li>
			<li>用镊子固定皮肤样本，同时用手术剪刀或手术刀的闭合圆头端轻轻分离皮肤与腹膜及背部肌肉。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备一个含有 10 ml 冰冷 PBS 的 100 mm 细胞培养皿。</li>
		<li>将皮肤样本浸入步骤 1.3.3 准备的含 PBS 的培养皿中，用镊子轻轻刮除皮下脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尾巴：
	<ol>
		<li>剪下小鼠尾巴。</li>
		<li>用手术剪刀或手术刀从尾根部开始，沿纵向剪至尾尖。</li>
		<li>用镊子将尾部皮肤剥离。用镊子夹住尾根部切口边缘，同时用手固定尾部主体，轻轻向尾尖方向拉扯皮肤。</li>
		<li>用镊子轻轻刮除皮肤样本上多余的脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>足垫：
	<ol>
		<li>用手术剪刀完整剪下小鼠足部，避免剪到任何带毛的皮肤。</li>
		<li>从踝关节至脚趾起始处，沿纵向切开足部皮肤。</li>
		<li>用手或镊子固定踝骨，同时用镊子夹住皮肤并向脚趾方向拉扯，如同脱去手套一般剥离皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 消化
<ol>
	<li>根据材料列表中的配制方法，用以下配方从储备液制备消化液：酶混合物（具体见材料列表）300 μg/ml，DNAse1 50 U/ml，用含5%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基稀释。</li>
	<li>将皮肤样本置于含有2 ml消化液的35 mm培养皿中，用剪刀剪成小块（对于躯干皮肤：每2 cm2皮肤使用2 ml消化液，最多不超过3 ml）。</li>
	<li>在37 °C孵育90分钟，孵育期间轻轻晃动培养皿1–2次。</li>
	<li>将消化后的皮肤样本倒入含有1 ml含5% FBS的RPMI1640培养基的66 mm培养皿中的70 μm细胞筛网上。</li>
	<li>用5 ml含5% FBS的RPMI1640培养基冲洗筛网。</li>
	<li>用注射器活塞将样本压过细胞筛网。</li>
	<li>用20 ml含5% FBS的RPMI1640培养基冲洗活塞、培养皿和筛网，并转移至50 ml离心管中。</li>
</ol>
3. 抗体与标记
<ol>
	<li>用 5 ml 的含 1% FBS（或 BSA）的 PBS 洗涤所得悬浮液两次。</li>
	<li>用所需的抗体标记所得的细胞悬液。
	<ol>
		<li>将样品重悬于 100 μl/样品的混合液中，该混合液含有用含 1% FBS 的 PBS 稀释至 2 μg/ml 的 aCD16/CD32（克隆号 2.4G2）。</li>
		<li>在 4 °C 孵育 15 分钟，以阻断所需抗体通过 Fc 受体发生的非特异性结合。</li>
		<li>加入 表 1 中列出的抗体。
		<ol>
			<li>将所需抗体用含 1% FBS 的 PBS 稀释至 4 μg/ml 的浓度，制备成 100 μl/样品的混合液。</li>
			<li>向每个样品中加入 100 μl 上述步骤 3.2.3.1 中制备的混合液，使管中抗体混合液总体积为 200 μl，终浓度为 2 μg/ml。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 孵育 30 分钟，并避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 1 ml 含 1% FBS 的 PBS 洗涤，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再重悬于 300 μl 含 1% FBS 的 PBS 中。</li>
	<li>加入 DAPI 至终浓度为 2 μg/ml，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>通过流式细胞术（FACS）分析所得样品。
	<ol>
		<li>为分离白细胞，请采用以下设门策略：
		<ol>
			<li>首先通过设门选择 DAPI 阴性（DAPI-）群体以排除死细胞。</li>
			<li>在 FSC-A 与 FSC-W 图中选择单细胞群体，如 图 1 所示。</li>
			<li>根据目标白细胞典型的大小和颗粒度进行设门。</li>
			<li>在 FSC-A 与 CD45 图中选择 CD45+ 细胞，如 图 1 所示。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过表面标志物的表达区分不同的白细胞群体，如下所示：
		<ol>
			<li>将树突状细胞（DCs）鉴定为 CD11c+ MHC II+ 细胞。后续可进一步分析 CD207 的表达，以区分朗格汉斯细胞和 CD207+ 真皮 DCs 与 CD207- 真皮 DCs。</li>
			<li>将巨噬细胞鉴定为 CD64+ F4/80+ 细胞。</li>
			<li>将 B 细胞鉴定为 CD19+ MHCII+ 细胞。</li>
			<li>将 T 细胞鉴定为 CD8+ 或 CD4+ 细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Streilein, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+and+signals+of+the+skin-associated+lymphoid+tissues+%28SALT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT).</a> Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).</li>
<li>Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skin-Resident+Immune+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+dermatology+reports%22%5BJournal%5D)">The Skin-Resident Immune Network.</a> Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+murine+skin+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to murine skin commensals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).</li>
<li>Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+conventional+dendritic+cells+in+the+induction+of+peripheral+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance.</a> Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+metabolize+sunlight-induced+vitamin+D3+to%27program%27T+cell+attraction+to+the+epidermal+chemokine+CCL27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27.</a> Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).</li>
<li>Vitali, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory%2C+and+not+lymphoid-resident%2C+dendritic+cells+maintain+peripheral+self-tolerance+and+prevent+autoimmunity+via+induction+of+iTreg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells.</a> Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).</li>
<li>Azukizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady+state+migratory+RelB%2B+langerin%2B+dermal+dendritic+cells+mediate+peripheral+induction+of+antigen-specific+CD4%2B+CD25%2B+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells.</a> European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).</li>
<li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+role+of+migratory+dendritic+cells+in+peripheral+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction.</a> The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).</li>
<li>Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+role+of+tissue-resident+immune+cells+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis.</a> Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).</li>
<li>Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitasking+organ%3A+recent+insights+into+skin+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The multitasking organ: recent insights into skin immune function.</a> Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+self+antigen+imprints+regulatory+memory+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues.</a> Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们描述了一种从小鼠不同皮肤区域制备单细胞悬液的方法。我们采用的消化方法不仅能够获得较高的细胞得率，而且能够保持表面标志物的表达，这对于后续的流式细胞分析至关重要。
使用胶原酶I和II与嗜热菌蛋白酶的混合酶液，可确保酶活性在不同批次间差异最小，从而使该方法具有高度可重复性。其他已发表的方法依赖于不同的酶混合物，但在我们的实践中，这些方法获得的细胞产量较低，更重要的是，可重复性较差。然而，我们的方法无法区分表皮中的细胞与真皮中的细胞。由于在许多情况下区分这两个不同区室可能具有重要意义，我们建议读者参考此前采用此类方法的研究工作15。
根据我们的经验，耳部和尾部的皮肤样本比躯干皮肤更容易消化，因为躯干皮肤需要彻底刮除皮下脂肪层，才能使真皮层充分接触酶混合液。去脂步骤以及切割操作都应迅速而轻柔地进行，以保持细胞活性。去脂时间过长或过于彻底可能会损伤皮肤中常驻的免疫细胞，从而导致回收细胞的数量显著降低且细胞活性下降。
还应注意，为了保持表面标志物的完整性，消...

皮肤是人体最大的器官之一，其巨大的表面积持续暴露于外部环境中。因此，皮肤必须通过物理屏障以及主动防御潜在病原体入侵的方式，保护机体免受潜在威胁，以维持内环境稳定。与肠道和肺黏膜类似，皮肤中定居着多种免疫细胞，这些细胞持续与上皮层相互作用，以维持免疫监视功能。这一涉及皮肤中免疫细胞与非免疫细胞的复杂系统，自免疫学早期便已得到认可；1978年，学者首次提出“皮肤相关淋巴组织”（Skin-associated lymphoid tissue, SALT）1这一术语，用以描述该系统的复杂性。
皮肤中存在大量免疫细胞，不仅有助于机体抵御潜在的侵袭，还能协调伤口愈合过程，并维持对自身抗原及皮肤微生物群的免疫耐受2,3。
在皮肤常驻免疫细胞中，树突状细胞（DCs）在调控免疫应答和维持稳态方面发挥着关键作用4。真皮DC和朗格汉斯细胞能够迅速响应病原体侵袭，并在迁移至淋巴结后激活T细胞，诱导新生成的效应T细胞表达皮肤归巢受体5。DCs在调节皮肤稳态中也具有基本作用。在稳态条件下，从真皮迁移至淋巴结的DCs会携带皮肤隔离的抗原，主要通过诱导针对皮肤抗原的调节性T细胞（Tregs）分化，从而诱导T细胞耐受6-8。
T细胞是皮肤中数量最多的免疫细胞群体。它们不仅在感染期间浸润皮肤，而且也是皮肤常驻淋巴细胞中稳定的组成部分9,10。CD8+和CD4+组织驻留记忆（rm）T细胞均存在于皮肤中，在感染发生后，能够在效应T细胞从血液中被募集之前迅速作出应答。皮肤中还存在一类组织驻留的调节性T细胞（Treg），能够维持对皮肤抗原的免疫耐受以及组织稳态。这些细胞在接触其特异性抗原后可被快速而强烈地激活，因此被定义为记忆型调节性T细胞（memory Tregs）11,12。
除了树突状细胞（DCs）和T细胞外，许多天然免疫细胞，如自然杀伤细胞（NK细胞）、γδ T细胞、2型固有淋巴样细胞（ILC2s）13、肥大细胞和巨噬细胞，也存在于皮肤中，并参与宿主防御。为了分析如此复杂的微环境，必须高效地从皮肤样本中获得单细胞悬液，同时保持细胞表面标志物的表达，以便进行流式细胞荧光分析或分选。
小鼠皮肤具有主要由角质形成细胞、朗格汉斯细胞和表皮树突状T细胞构成的外层表皮，以及其下方的真皮层。真皮层含有大部分免疫细胞，并由细胞外基质构成，其中胶原纤维含量最为丰富，尤其是I型胶原和IV型胶原。与人类皮肤不同，小鼠皮肤被毛发覆盖，因此含有更密集的毛囊。此外，小鼠皮肤比人类皮肤薄得多，并包含一层称为panniculus carnosus的肌肉层，有助于伤口愈合14。这些特性使得有效破坏真皮层中的胶原网络以获取免疫细胞变得更加困难。
本文提供了一种适用于消化细胞外基质的方法，该方法依赖于高纯度胶原酶1、胶原酶2与嗜热菌蛋白酶组成的混合酶液。此外，由于不同部位皮肤的分析需要采用不同的实验流程，我们将展示从足垫、尾部、耳部及躯干部高效获取皮肤样本的多种方法。随后，我们将对样本进行标记，以检测树突状细胞（MHCII+CD11c+CD45+）、巨噬细胞（CD11b+F4/80+CD45+）、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的存在情况。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>添加物补充的 RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 添加 L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素，不含 β-巯基乙醇</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM（酶混合物）</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 重悬至 [2.5&amp;nbsp;mg/ml]；分装后于 -20&amp;nbsp;&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>用无血清 RPMI 1640 重悬 [1,000&amp;nbsp;U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>66 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;消化液混合物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>用含 5% FBS 的 RPMI 稀释</td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td></td><td></td><td>300 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;克隆号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;标记&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

从小鼠皮肤不同区域制备用于流式细胞分析的单细胞悬液

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

皮肤是一种与外部环境相互作用的屏障器官。由于持续暴露于潜在的微生物侵袭，真皮和表皮在稳态和炎症状态下均定植有多种免疫细胞。因此，获取皮肤细胞用于流式细胞分析的工具对于研究皮肤内复杂的免疫细胞网络及其对微生物刺激的反应非常有用。本文介绍了一种高效消化小鼠皮肤的方法，可快速、高效地获得单细胞悬液。该方案能够在不损害表面抗原表达的前提下，最大程度地维持细胞活性。我们还描述了如何从耳部、躯干、尾部和足垫等不同解剖部位采集并消化皮肤样本。所得细胞悬液经染色后通过流式细胞术进行分析，以区分不同的白细胞群体。

根据所述方案对身体不同部位的皮肤进行消化处理，并用指定抗体染色。分选策略如图1所示：首先选择活细胞（DAPI阴性细胞），然后圈选单细胞（FSC-A 对 FSC-W）以及具有淋巴细胞形态的细胞（FSC-A 对 SSC-A）。如需，进一步选择造血来源的CD45+细胞。
DCs 用抗 CD11c、MHCII 和 CD45 抗体进行标记，巨噬细胞鉴定为 F4/80+ CD64+ CD45+ 细胞，B 细胞鉴定为 CD19+CD45+ MHCII+ 细胞，CD4+ T 淋巴细胞鉴定为 CD4+CD45+ 细胞，CD8+ T 淋巴细胞鉴定为 CD8+CD45+<...

皮肤是复杂免疫细胞网络的栖息地。本文介绍一种高效的小鼠皮肤消化方法，适用于动物身体不同部位的皮肤，以获得单细胞悬液，并通过流式细胞术分析皮肤中定居的各种白细胞群体。

皮肤是一种屏障器官，与外部环境相互作用。由于持续暴露于潜在的微生物侵袭，真皮和……

本实验的总体目标是从小鼠皮肤制备单细胞悬液，通过流式细胞分析鉴定皮肤中不同类型的常驻免疫细胞群体，并实现其分离。利用该技术，研究人员可轻松消化小鼠皮肤不同区域的样本，同时不损伤目标免疫细胞表面标志物。为了获取小鼠耳部皮肤样本，剪下耳部无毛部分，并用镊子将器官的背侧和腹侧分开。然后轻轻刮除耳内侧，以去除残留的软骨。为了获取组织块皮肤样本，先用剪刀剃除动物全身所有毛发，再涂抹脱毛乳液。数分钟后擦去乳液，在小鼠背部中央做一垂直切口，并沿小鼠身体周围剃毛区域的边界继续延伸切口。用镊子固定皮肤，同时用手术剪闭合的圆头端或解剖刀分离组织，轻轻将皮肤与腹膜及背部肌肉分开。随后将皮肤浸入含有10 mL冰冻PBS的100 mm细胞培养皿中，并用镊子刮除皮下脂肪。为获取尾部皮肤样本，剪下尾部，并使用手术剪从尾根部开始沿纵向剪至尾尖。用镊子夹住尾根部切口边缘，再用另一把镊子夹住尾部主体，轻轻将皮肤向尾尖方向剥离。通过轻柔刮除皮肤样本上的多余脂肪组织，以去除多余脂肪。剪下小鼠的足部，然后为了从足垫获取皮肤样本，使用手术剪从踝关节到脚趾起始处纵向剪开足部皮肤，注意避免剪到任何毛发。接着用镊子夹住踝骨，另一只手抓住皮肤，像脱手套一样将皮肤向脚趾方向拉下。为了标记皮肤细胞，依次将每个样本转移至含有2毫升 freshly prepared digestion cocktail 的35毫米培养皿中。用剪刀将样品剪成小块，在37摄氏度下孵育组织碎片90分钟，孵育期间轻柔振荡一至两次。接着，将消化后的皮肤组织倒入含有1毫升添加了FBS的RPMI 1640培养基的66毫米培养皿中的70微米细胞筛网上。用5毫升新鲜培养基冲洗筛网，然后使用注射器活塞将样品挤压通过筛网滤孔。用20毫升新鲜培养基冲洗活塞、培养皿和滤网，并将组织悬液转移至50毫升锥形管中。待所有样品处理完毕后，离心细胞，并将沉淀重悬于每份样品100微升的PBS缓冲液中，其中含1% FBS及2微克/毫升的抗CD16/CD32封闭抗体。在4摄氏度孵育15分钟后，避光条件下向相应样品中加入100微升抗体（具体抗体见表格说明），在4摄氏度继续孵育30分钟。孵育结束后，用一毫升含FBS的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于300微升含FBS的PBS中。然后在避光条件下，于4摄氏度用每毫升2微克的DAPI对细胞染色10分钟。为分离白细胞，首先圈选DAPI阳性细胞群以去除死细胞。然后通过前向散射面积与前向散射宽度图选择单细胞群体，并根据目标白细胞的大小和颗粒度对细胞设门。接着，选择CD45阳性细胞，随后根据CD11C和MHC II类分子的表达情况鉴定每个样本中的皮肤树突状细胞群体。通过CD64和F480的表达鉴定巨噬细胞，通过CD19和MHC II类分子的表达鉴定B细胞，通过CD4或CD8的表达鉴定T细胞。如上所述，皮肤免疫细胞的分离可从皮肤各区域获得活力超过50%的细胞，每平方厘米皮肤中约有5,000至15,000个CD45阳性细胞。从小鼠皮肤一平方厘米组织中，也可获得足够数量的树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞，用于后续分析，如上所述。观看本视频后，您应能够充分掌握如何消化非炎症性皮肤组织，并分离白细胞用于流式分析。

preparation-single-cell-suspensions-for-cytofluorimetric-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

单细胞悬液的细胞荧光分析从不同的鼠标皮肤区域准备

癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本视频介绍了一种从新生小鼠皮肤中快速分离并同时培养黑素细胞和成纤维细胞的方法。这些细胞可被长期维持并进行实验操作 体外...

快速培养原代小鼠黑素细胞和成纤维细胞：从小鼠全皮组织样本中分离黑素细胞和成纤维细胞

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来，随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞，从而获得单细胞悬液。...

制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

我们介绍一种高效分离人皮肤活检组织中皮肤常驻T细胞的实验方案。该方案可获得足量的活人皮肤常驻淋巴细胞，用于流式细胞术分析。 离体...

从人皮肤中分离淋巴细胞用于表型分析 离体 细胞培养

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

研究成体干细胞生物学的理想模型是小鼠毛囊。本文介绍了一种分离不同群体毛囊干细胞和表皮角质形成细胞的方案，该方法包括对小鼠背部皮肤进行酶消化处理，随后进行流式细胞术分析。...

从背侧小鼠皮肤中分离毛囊干细胞与表皮角质形成细胞

本报告介绍了一种CUBIC方法，用于透明化全厚度小鼠皮肤活检样本，并在三维空间中以单细胞分辨率可视化蛋白表达模式、增殖细胞及皮脂细胞。该方法可准确评估皮肤解剖结构与病理特征，以及基因修饰小鼠品系中的表皮异常表型。...

CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白表达

本方案描述了如何从小鼠模型中分离皮肤角质形成细胞，使用金属标记抗体进行染色，并通过质谱流式细胞术分析染色后的细胞，以表征目标蛋白在不同细胞周期阶段中的表达模式。...

用于质谱流式细胞术进行细胞周期特异性细胞蛋白表达分析的小鼠皮肤角质形成细胞的分离与染色

本文介绍了一种高效的荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，适用于通过靶点切割和核酸酶释放技术（CUT&amp;RUN）研究肌纤维中转录调控。...

一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

我们描述了制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的实验方案。...

小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

本方案提供了一种从健康及荷瘤小鼠肺组织中分离高质量单细胞悬液的详细方法。该方案可应用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术分析以及原代细胞的分离。...

优化的小鼠荷瘤肺组织制备方法用于流式细胞术和单细胞RNA测序

学习从小鼠皮肤不同区域制备单细胞悬液并进行流式细胞术分析的方法，用于识别驻留免疫细胞群体。该技术可完整保留细胞表面标志物，适用于免疫学和细胞生物学研究。

从小鼠皮肤不同区域制备用于流式细胞分析的单细胞悬液

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