Name: Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von rAAV9-Vektoren zur Manipulation der Genexpression in Mäuseherzen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien in vivo ohne genetisch modifizierte Tiere.

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Wir danken Dr. Zaffar Haque für die sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Wir danken Dr. Masaharu Kataoka und Dr. Gengze Wu für die Gespräche und Hilfe. Die Arbeit im Wang-Labor wird von der American Heart Association, der Muscular Dystrophy Association und dem NIH unterstützt (HL085635, HL116919, HL125925).

Alle beschriebenen Schritte wurden unter Protokolle, die von der Kommission für Biosicherheit und der Institutional Animal Care und Use Committee von Boston Kinderkrankenhaus zugelassen durchgeführt. Boston Kinderkrankenhaus hat pathogen-freie Maus Einrichtungen mit geregelten Hell / Dunkel-Zyklen und Klimaanlagen. Veterinärwesen und Tierpflegepersonal Käfige ändern und die Gesundheit der Mäuse zu gewährleisten. Die Einrichtungen sind AAALAC zertifiziert und haben aktive Tierschutzsicherung Zertifizierung (AAALAC Akkreditierung erteilt am 1992.02.24 Animal Welfare Assurance Nummer:. A3303-01). Mäuse wurden durch CO 2 aus einer Druckgasquelle geliefert euthanasiert. Gewebeproben wurden gesammelt, nachdem dass die Herzfrequenz, Bewegung bestätigt, und die Atmung der Tiere aufgehört hatte. Neonatal Nagetiere sind resistent 2 Euthanasie zu CO und wurden durch Enthauptung mit einer scharfen Schere eingeschläfert. Diese Verfahren sind im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association. 1. Erzeugung von rAAV9 Konstrukten durch eine cDNA oder shRNA Expressionskassette in das Plasmid Backbone Cloning HINWEIS: Das rAAV9 Plasmid, das invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) von AAV 2 enthält, für Genüberexpression verwendet wurde modifiziert, um das Huhn TNNT2 zum Hafen Promotor (rAAV9.cTNT), die 25,26,29 Kardiomyozyten-spezifische Expression von transduzierten Genen ermöglicht. Einzigartige NheI und KpnI-Stellen wurden in das Plasmid stromabwärts des Promotors eingeführt. Die cDNA - Fragmente , die die Gene von Interesse kodieren , können in das rAAV9 Rückgrat diese beiden Restriktionsstellen 25,26,29 mit geklont werden. Hier wird als Beispiel die rAAV9 Vektor für die Überexpression des GFP-Gens in Mäuseherzen wurde erzeugt. Das resultierende Plasmid enthält das cTnT :: GFP - Kassette flankiert von zwei ITR Stellen (Abbildung 1). rAAV9.U6 :: shRNA Konstrukte wurden für Knock-Down 25 verwendet. Design-shRNAs mitOnline-shRNA-Design-Servern. rAAV9.U6 :: shRNA kann entweder durch Glühen und Ligieren DNA-Oligos haltigen shRNA-Sequenzen in die Restriktionsenzym-verdaute rAAV9 Vektoren beherbergen die U6-Promotor oder durch Langstrecken-PCR und intramolekulare Gibson Montage-basierte &quot;nahtlos&quot; erzeugt werden Bau 30. Das resultierende Plasmid sollte die U6-shRNA Kassette durch zwei ITR Seiten (Figur 2) flankiert enthalten. Hier wird als Beispiel die rAAV9.U6 :: shRNA Vektor wurde konstruiert TRBP mRNA (TRBP shRNA-Sequenz: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG) zum Knockdown. Ein Gerangel shRNA wurde als negative Kontrolle (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG) verwendet. <ol><li> Klonen Sie die cDNA oder shRNA Expressionskassette in das rAAV9 Plasmidbackbone. Wandeln Sie die DNA in kompetente E. coli - Zellen 25. HINWEIS: Verwenden Sie stbl2 oder stbl3 E. coli - Zellen für rAAV9 DNA - Transformation unerwünschte ITR Rekombination zu minimieren. </li><li> Heb die ... Aufpositiver Klon aus den transformierten E. coli - Zellen. Amplify die Kultur in 500 ml Lilly-Barnett Medium und extrahieren Sie die rAAV9 Plasmid aus den Bakterienzellen 25-30. HINWEIS: Midi / Maxi prep die rAAV9 Plasmid, das eine hohe Menge an DNA (&gt; 100 &amp; mgr; g) zu erhalten. Bevor das Virus zu erzeugen, analysieren immer die Sequenzintegrität der AAV-Plasmide durch Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> 2. Transfektion von HEK293-Zellen mit rAAV9 Plasmiden <ol><li> Bereiten Sie 1 ug / ul von linearen Polyethylenimin (PEI) -Lösung. Auflösen PEI - Pulver in Endotoxin-freiem dH 2 O , das auf 70-80 ° C erwärmt wurde. Nach dem Abkühlen auf RT ab, neutralisiert die Lösung auf pH 7,0 mit 1 M HCl. Filter zu sterilisieren (0,22 &amp; mgr; m) wurde die Lösung. Aliquot der 1 ug / ul PEI-Stammlösung (1400 ul / Röhrchen) und speichern Sie die solutIon bei -20 ° C. </li><li> Kultur HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 ± 0,5% Kohlendioxid (CO 2). </li><li> Am Tag 0, Platte HEK293 Zellen in zehn 150 mm-Schalen von 18-20 Stunden vor der Transfektion durch Spaltung&gt; 90% konfluenten Zellen in einer 1: 2 Verdünnung. HINWEIS: Am Tag 1 sollten die Zellen 90% Konfluenz erreichen. </li><li> Am Tag 1, transfizieren HEK293 - Zellen mit dem rAAV9 Plasmid (zB rAAV9.cTNT :: GFP oder rAAV6.U6 :: shRNA Konstrukte), Ad-Helferplasmid und AAV-Rep / Cap - Plasmid unter Verwendung von PEI 25,26,29. <ol><li> Für 10 Gerichte der Zellen bei 90% Konfluenz, 70 &amp; mgr; g in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen AAV-Rep / Cap-Plasmid, 70 &amp; mgr; g pf rAAV9 Plasmid und 200 ug Ad-Helferplasmid mischen. </li><li> Wenn die Zellen weniger konfluent sind, proportional angepasst werden die DNA-Menge. Zum Beispiel, wenn die Zellen bei 75% konfluent sind, reduzieren dieDNA-Menge proportional (75/90 der Menge in Schritt gezeigt 2.4.1): mix 70 x 75/90 = 58,3 ug AAV-Rep / Cap Plasmid, 70 x 75/90 = 58,3 ug rAAV9 Plasmid und 200 x 75/90 = 166,7 &amp; mgr; g Ad-Helferplasmid in einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> In 49 ml RT DMEM (ohne FBS) auf die 50-ml-Tube und gut mischen. </li><li> In 1360 ul PEI-Lösung, um das PEI machen: DNA-Verhältnis (v / w) sein 4: 1. Gut mischen. bei RT inkubieren 15 - 30 min. </li><li> 5 ml des Gemisches hergestellt in Schritt 2.4.4 auf jede 150-mm-Schale (50 ml des Gemisches für zehn 150 mm-Schalen). </li></ol></li><li> Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 ± 0,5% CO 2 für 60-72 Std. </li></ol> 3. Ernte von HEK293 Zellen und Reinigung von rAAV9 Vektoren <ol><li> Ernten Sie die Zellen 60-72 h nach der Transfektion. Vertreiben und die Zellen in den Gerichten aussetzen durch Auf- und Abpipettieren mit dem Kulturmedium. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in sterile50-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Zellpellet mit 5 ml PBS in jedes Röhrchen und kombinieren die alle Zellsuspensionen in ein 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Überstand verwerfen. Bei diesem Schritt speichert das Zellpellet bei -80 ° C oder unmittelbar die AAV aus dem Pellet zu reinigen, wie 3,4 bis 3,15 in Schritten beschrieben. </li><li> Vorbereitung der Lysepuffer: 150 mM NaCl und 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Filter zu sterilisieren (0,22 uM). Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet mit 10 ml Lyse-Puffer. </li><li> Frieren Sie das Lysat bei -80 ° C oder in Trockeneis / Ethanol-Bad, dann Tauwetter es bei 37 ° C. Vortex für 1 min. Einfrieren und Auftauen des Lysats 3 mal. </li><li> In MgCl2 Lösung des aufgetauten Lysats (machen die endgültige Konzentration von MgCl 2 in dem Lysat sein 1 mM). Fügen Sie die Nuklease zu einer Endkonzentration von 250 U / ml. für 15 min bei 37 ° C inkubieren, um die DNA / Protein aggr aufzulösenegation. HINWEIS: Wenn die DNA / Protein-Aggregation nicht nach Nuklease oder Endonuklease Behandlung gelöst bekommt, Dounce homogenisieren die Lysate 20-mal. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.800 × g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand. </li><li> Unterdessen bereiten die Iodixanol Gradienten-Lösung: <ol><li> Bereiten Sie die 17% des Gradienten durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 10 ml 5 M NaCl und 12,5 ml ofdensity Gradienten Medium. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml mit H 2 O. </li><li> Bereiten Sie die 25% ige Lösung durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml Dichtegradientenmedium, und 0,2 ml von 0,5% (w / v) Phenol Red. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml mit H 2 O. </li><li> Bereiten Sie die 40% ige Lösung durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, und 33,3 ml Dichtegradientenmedium. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml unter Verwendung vonH 2 O. </li><li> Bereiten Sie die 60% ige Lösung durch Mischen von 0,05 ml von 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml Dichtegradientenmedium, und 0,1 ml von 0,5% (w / v) Phenol Red. </li></ol></li><li> Mit einer Nadel und Spritze, laden die Iodixanol Gradientenlösung in die Polypropylenröhrchen in der Größenordnung von 5 ml von 17%, 5 ml von 25%, 5 ml 40% und 5 ml von 60%, von unten beginnend. Laden Sie alle aus Schritt erhaltenen Lysat 3,8 (14-16 ml) auf der Oberseite des Gradienten. Der Gradient, von unten nach oben aufgelistet, 60%, 40%, 25%, 17%, und das Lysat Schicht. Füllen Sie das Rohr mit Lysepuffer und decken Sie es mit dem Korken. </li><li> Zentrifuge bei 185.000 xg für 90 min bei 16 ° C. </li><li> Ernte der viralen Fraktion (40% Schicht) mit einer Spritze. Führen Sie die Nadel (21 Gauge) in die Kreuzung zwischen den 40% und 60% Fraktionen, nur die 40% Schicht abgesaugt. HINWEIS: Vermeiden Sie die 25% Schicht abgesaugt. </li><li> Mischen Sie die Virus-Fraktion mit sterilisierten Polyoxyethylen-polyoxypropropylen-Blockcopolymer PBS-Lösung (10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer Lager 1: 10.000 in PBS) bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml. Legen Sie die Mischung in das Filterrohr (cut-off MW = 100 kD). Zentrifuge bei 2.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie die Lösung an der Unterseite. Nachfüllen des Filterrohr mit Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-PBS-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 15 ml. Zentrifuge bei 2.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. Sammeln Sie die gereinigte rAAV9-Virus (die Fraktion über dem Filter). </li><li> Übertragen Sie das gereinigte rAAV9 im Filterrohr auf 1,7-ml-Röhrchen. Aliquot der gereinigten rAAV9 (100-400 &amp; mgr; l / Röhrchen in Abhängigkeit von dem Volumen und Titer des AAV) und Speichern des Virus bei -80 ° C. HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-taut. </li></ol> 4. Messung der Titer von rAAV9 <ol><li> Bereiten Sie Standard - DNA - Proben. <ol><li> Entwerfen Sie spezifische und effiziente PCRPrimer für rAAV9 Vektoren und Optimierung der PCR-Bedingungen. HINWEIS: Die Primer, die in dieser Studie verwendet werden, sind &quot;Forward: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverse: TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot;. Die PCR-Reaktion wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 20 sec, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 10 sec; und die abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min. Jedoch sind die optimierten Primer und PCR - Bedingungen plasmid-spezifisch, da die eingesetzte Sequenz in der rAAV9 Vektor , der die Spezifität und Effizienz der PCR 31 beeinflussen können. </li><li> Führen Sie die PCR-Reaktion mit den in Schritt 4.1.1 gezeigten Bedingungen. Reinige das PCR-Produkt mit einem Gel-Extraktions-Kits. </li><li> Messen der Konzentration von gereinigter DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen der Konzentration der DNA-Molekülzahlen bezogen auf das Molekulargewicht / Länge des PCR-Produkts. <ol><li> Berechnen Sie die molekulare Konzentration der folgenden Gleichung: momolekulare Konzentration (DNA - Moleküle oder Fragmente / ml) = 6,23 x 10 23 mol -1 x Con. x 10 -6 / MW. Anmerkung: (6.23 x 10 23 mol -1 ist Avogadroschen Number; Con .: DNA - Konzentration in &amp; mgr; g / ml; MW .: Molekulargewicht in g / mol). wenn die erhaltene Konzentration des PCR-Produkts von 100 &amp; mgr; g / ml zum Beispiel ist und seine Länge ist 200 bp, das Molekulargewicht des doppelsträngigen DNA 2 x 200 x 310 = 124000 (das mittlere Molekulargewicht jedes Nukleotid in der einzelsträngige DNA ist etwa 310 g / mol). Die molekulare Konzentration (DNA - Moleküle / ml) = 6,23 X 10 23 mol -1 x 100 &amp; mgr; g / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 DNA - Moleküle / ml. </li><li> Durchführen einer Verdünnungsreihe des DNA - Fragments und Herstellung der Standardproben mit Konzentrationen von 10 13 Molekülen / ml, 10 12 Molekülen / ml, 10 11 Molekülen / ml, 10 10 Molekülen / ml, 10 9 Moleküle / ml, 10 <sup&gt; 8 Molekülen / ml und 10 &amp; sup7 ; Moleküle / ml. Verwenden Sie 1 ul Lösung für jede Standardprobe für die quantitative PCR (qPCR, in Schritt 4.6). </li></ol></li></ol></li><li> Mix 5 &amp; mgr; l gereinigtem rAAV9 Lösung mit 5 ul 10fach DNAse - Puffer, 1 &amp; mgr; l DNAse (10.000 U / ml) und 39 &amp; mgr; l ddH 2 O. Das Gesamtvolumen 50 &amp; mgr; l sein sollte. </li><li> Inkubiere die Phiole bei 37 ° C für 30 min Restunverpackten Plasmid-DNA zu entfernen. </li><li> Inaktivieren der DNAse bei 95 ° C für 10 min. Die Lösung wird nach unten, fügen Sie 44 ul H 2 O, 5 ul 10x DNAse Puffer und 1 ul Proteinase K Lager (10 mg / ml). </li><li> Inkubieren der Lösung bei 50 ° C für 2 Stunden. Stoppen Sie die Reaktion und inaktivieren die Proteinase K bei 95 ° C für 10 min. </li><li> Verwenden Sie 1 ul der Probe für die quantitative PCR (qPCR) Assay. Berechnen Sie den Titer. <ol><li> Führen quantitative PCR (qPCR) mit den entworfenen Primer in Schritt 4.1.1 die Proben fr mitom Schritt 4.1.4 (Standardproben) und aus Schritt 4.5 (Proben gemessen werden). <ol><li> Für jede Reaktion, Mischungs 10 ul 2x Grün Mastermix (enthaltend Taq - Polymerase, dNTP - Mix, Puffer, MgCl 2 und Grün - Farbstoff), 0,5 &amp; mgr; l Vorwärts - Primer (5 &amp; mgr; M), 0,5 &amp; mgr; l Rückwärts - Primer (5 &amp; mgr; M), 8 &amp; mgr; l H 2 O und 1 ul der Probe gemessen werden. Führen qPCR mit den folgenden Bedingungen: Halten der Proben bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 10 min; 40 Zyklen bei 95 ° C durchzuführen für 15 sec und bei 60 ° C für 1 min; für die Schmelzstufe, Inkubation der Proben bei 95 ° C für 30 sec und 60 ° C für 15 sec. Generieren Sie die Standardkurve auf der Basis der C T - Nummern der Standardproben (Abbildung 3). </li></ol></li><li> Berechnen Sie die molekulare Konzentration / Titer der AAV Probe gegen die Standardkurve. Die rAAV9 hat einen Einzelstrang-DNA-Genom, so dass die molekulare Konzentration wird 2-fach höher als dieberechneter Wert (2x Leistung (10, y), 3B). Darüber hinaus wird der Titer des gereinigten rAAV9 sein 20-fach höher als das, was bei der Berechnung aufgrund der 1:20 Verdünnung des Virus in DNAse und Proteinase K-Reaktionen (5 &amp; mgr; l in 100 &amp; mgr; l insgesamt) erhalten. </li></ol></li></ol> 5. rAAV9 Injektion in neugeborenen Mäusen und Gene Expression Assays im Herzen <ol><li> Bereiten Sie rAAV9 Arbeitslösungen in Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer PBS-Lösung. Machen Sie den Virusstamm mit den Titern von 1-7 x 10 12 Partikel / ml. HINWEIS: 50-70 ul rAAV9 Lösung in jedes postnatalen Tag 0,5-1,5 Maus durch subkutane Injektion liefern. Um eine effiziente Genüberexpression oder Zuschlags zu erreichen, ist es empfehlenswert, einen Pilotversuch für jede Studie durchzuführen, um die Menge des injizierten AAV zu optimieren. Verwenden Sie die gleiche Menge an rAAV9.cTNT :: Luc oder rAAV9.U6 :: Gerangel Kontrollen für jede Studie die Vorspannung zu minimieren. HINWEIS: Wir haben 1-1,5x 10 11 Partikel / pup zur Überexpression und 2,5-5 x 10 11 Partikel / Welpe für Zuschlag in postnatalen Tag 0,5-1,5 mi ce). </li><li> Behandeln neugeborenen Mäusen mit rAAV9 bei P0.5-P2.5 durch subkutane Injektion. <ol><li> Vorfüllen eine 29G1 / 2, 0,33 x 12,7 mm Insulinspritze mit der rAAV9 Lösung. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Kryo-narkotisierten Welpen in einer Hand mit Daumen und Zeigefinger. Vor der Injektion bewegen, um die Rückenhaut des Welpen mit einem Stock Tupfer mit 70% Isopropylalkohol gesättigt, um die sterile Zustand zu halten. Legen Sie die Spritzennadel in die anterior-dorsalen Subkutis des Tieres in einem Winkel von 5 bis 10 °. Injizieren 50-70 ul der rAAV9 Lösung, um die Insulin-Spritze. HINWEIS: rAAV9 kann auch über intraperitoneale oder intravenöse Injektion 26,27 an der Maus geliefert werden. Effiziente Expression der gelieferten Gene im Herzen erhalten werden. Allerdings intraperitoneale InjectIonen manchmal in leaky-Expression in der Leber führen. Nach der Injektion wurde der Zustand der Welpen täglich überwacht. </li></ol></li><li> Die Ebene der Genexpression im Herzen kann mit qPCR, Immunofluoreszenz oder Western - Blot überwacht werden 25,26 (repräsentative Ergebnisse sind in den Abbildungen 4 und 5 gezeigt). HINWEIS: Die Mäuse wurden durch CO 2 aus einer Druckgasquelle geliefert euthanasiert. Gewebeproben wurden gesammelt, nachdem bestätigt, dass die Herzfrequenz, Bewegung und Atmung der Tiere aufgehört hatte. Neonatal Nagetiere sind resistent 2 Euthanasie zu CO und wurden durch Enthauptung mit einer scharfen Schere eingeschläfert. Das Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent. </li></ol>

<ol><li>Primrose, S. B., Twyman, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrimrose%2C+SB+%22Principles+of+gene+manipulation+and+genomics%22">Principles of gene manipulation and genomics</a>. , John Wiley & Sons. (2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -O., Trono, D., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tool+for+conditional+gene+expression+and+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile tool for conditional gene expression and knockdown.</a> Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).</li>
<li>Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Gene+Delivery+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Advances in Gene Delivery Systems.</a> BioMed Res. Int. 2015, 610342(2015).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in gene delivery systems.</a> Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+gene+delivery+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated gene delivery for human gene therapy.</a> J. Control Release. 161, 377-388 (2012).</li>
<li>Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+gene+therapy+approaches+for+osteosarcoma+using+viral+vectors%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review.</a> Bone. 40, 797-812 (2007).</li>
<li>De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+c-Kit+signaling+pathway+in+mouse+primordial+germ+cells+by+retroviral-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).</li>
<li>Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+delivery+into+male+germ+line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells.</a> FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).</li>
<li>Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell+cycle+status+on+early+events+in+retroviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication.</a> J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).</li>
<li>Escors, D., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+in+gene+therapy%3A+their+current+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).</li>
<li>Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+lentiviral+vector+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recent advances in lentiviral vector development and applications.</a> Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).</li>
<li>Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+retroviral+genome+and+the+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of retroviral genome and the packaging.</a> Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).</li>
<li>Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglas%2C+JT+%22Gene+Delivery+to+Mammalian+Cells%3A+Volume+2%3A+Viral+Gene+Transfer+Techniques%22">Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques</a>. , 3-14 (2004).</li>
<li>Armendáriz-Borunda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+first+generation+adenoviral+vectors+for+preclinical+protocols%3A+amplification%2C+purification+and+functional+titration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration.</a> J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).</li>
<li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene delivery.</a> J Gene Med. 1, 166-175 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+transfer+in+porcine+myocardium+after+coronary+infusion+of+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector.</a> Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).</li>
<li>Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaspar%2C+BK+%22J.+Gene.+Med%22">J. Gene. Med</a>. 7, 316-324 (2005).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trbp+regulates+heart+function+through+microRNA-mediated+Sox6+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression.</a> Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+YAP+activation+improves+cardiac+function+and+survival+in+an+experimental+murine+MI+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model.</a> Circ. Res. 115, 354-363 (2014).</li>
<li>Wahlquist, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-25+improves+cardiac+contractility+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart.</a> Nature. 508, 531-535 (2014).</li>
<li>Carroll, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+adult+cardiac-specific+gene+deletion+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).</li>
<li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342, 111-114 (2013).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype-dependent+packaging+of+large+genes+in+adeno-associated+viral+vectors+results+in+effective+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).</li>
<li>Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+trans-splicing+as+a+means+for+viral+vector-mediated+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).</li>
<li>Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart%2C+but+not+liver%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894(2013).</li>
<li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Es ist wichtig, unerwünschte ITR Rekombination während der Plasmidkonstruktion zu minimieren. Bevor das Virus zu erzeugen, muss man immer die ITR Integrität der AAV-Plasmiden überwachen durch Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese. Es ist unmöglich, 100% intakte Plasmide zu erhalten, aber die Rekombination Verhältnis sollte so weit wie möglich minimiert werden. Weniger als 20% ist akzeptabel für erfolgreiche rAAV9 Verpackung. Bemerkenswert ist, bei einer niedrigeren Temperatur die Bakterien Kultivierung (30 ° ...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Steuern Expression oder Aktivität von spezifischen Genen in verschiedenen biologischen Systemen ist eine wertvolle Strategie bei der Untersuchung der Genfunktion 1 geworden. Eine direkte Mittel, um dieses Ziel zu erreichen, ist zu Nukleotid-Sequenzen manipulieren und Mutantenallelen erzeugen. Obwohl machen präzise, ​​gezielte Veränderungen des Genoms von lebenden Zellen ist noch eine zeitaufwendige und arbeitsintensive Praxis, die Entwicklung der mächtigen TALEN und CRISPR / Cas9 Tools hat eine neue Ära der Genom Bearbeitung 2-5 geöffnet. Eine Routinelaborverfahren zur Genmanipulation hat sich auf die Einführung von genetischem Material (DNA und RNA - kodierenden Sequenzen oder siRNAs / shRNAs enthält) fokussiert in die Zellen , die das Gen (e) von Interesse 1,6 zum Ausdruck bringen oder Knockdown. In vielen Fällen ist der Haupt Engpass für Genmanipulation die Abgabe von DNA, RNA oder Protein in die Zellen. Im Hinblick auf die in vitro - Studien, effiziente transfectiauf Systeme wurden in vielen kultivierten Zellinien etabliert. Im Mausmodell ist jedoch, insbesondere in vivo Genübertragung anspruchsvoller. Es gibt eine Reihe extra- und intrazelluläre Barrieren, um umgangen werden müssen effiziente zelluläre Aufnahme der exogenen Reagenzien zu erreichen. Weitere Hindernisse sind die schnelle Clearance und die kurze Dauer der 7,8 gelieferten Materialien. Eine Strategie , um diese Probleme zu umgehen , ist die virale Vektoren als &quot;Träger&quot; zu verwenden oder &quot;Vehikel&quot; für in vivo - Genübertragung. Die natürlich entwickelte Transduktionseigenschaften von Viren ermöglichen die effiziente Bereitstellung eines Gens von Interesse in Zellen 7,9,10. Zahlreiche Arten von viralen Vektoren wurden in vivo Genmanipulation in verschiedenen Zelltypen und Organe in Mäusen entwickelt und flexible ermöglichen. Die am häufigsten verwendeten viralen Systeme umfassen Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus (AAV) <sbis&gt; 11. Retroviren sind RNA - Viren einzelsträngig und kann in stabiler Weise während der mitotischen Teilung, sofern das Potential für lebenslangen Expression der transduzierten Gene in die Zielzellen und Organen 12-14 ihres genetischen Materials in die Wirtszellgenom einzuführen. Viele Arten von Retroviren jedoch infizieren nur sich teilende Zellen, und ihre Wirksamkeit in sich nicht teilende Zellen ist sehr gering 15. Dies schränkt ihre Nützlichkeit für den Gentransfer. Lentivirus ist eine Gattung der Retroviridae Familie. Unterscheidet sich von anderen Retroviren, Lentivirus kann infizieren sowohl Dividieren und nicht teilende Zellen und wurde für den Gentransfer in post-mitotische und hochdifferenzierten Zellen 16 verwendet. Der Lebenszyklus von Lentivirus beinhaltet auch die Integration von Vektor-DNA in das Wirtsgenom. Somit ermöglicht Lentivirus-vermittelte Genabgabe stabile und langzeitige Expression der transduzierten genetischen Elemente 16-18. Jedoch kann dieses Merkmal eine Doppel e darstellendged Schwert in der Verwendung dieser Viren die Genexpression zu manipulieren, da die Integration von Vektor-DNA zur Insertionsmutagenese führen in den Wirtszellen und können artifizielle Wirkungen verursachen. Adenovirus ist ein weiteres weit verbreitetes Genabgabesystem. Im Gegensatz zu Retroviren und Lentiviren, Adenoviren sind nicht integriert und nicht mit der genomischen Integrität von Wirtszellen 8,10,11,19 stören. Zusätzlich können Adenoviren DNA in viele Zelltypen zu transfizieren, und die Infektion ist nicht abhängig von aktiven Zellteilung 19. Ein weiteres wichtiges Merkmal von Adenoviren ist die Leichtigkeit der Vektor Reinigung, da die viralen Vektoren haben die Fähigkeit , 19,20 repliziert werden. Allerdings ist der Haupt Einschränkung dieses Systems , dass Adenovirus - Infektion 19 starke Immunantworten in Zielzellen und Organen auslösen können, deren Verwendung in vielen Untersuchungen beschränken, insbesondere in Gentherapiestudien. Im Vergleich zu diesen anderen Typs von viralen Vektoren, rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) scheint die ideale Genabgabesystem 21,22 sein. Es zeigt minimale Immunogenität und Pathogenität 23,24. Darüber hinaus infiziert rAAV ein breites Spektrum von Zelltypen, einschließlich sowohl Unterteilungs- und nicht teilende Zellen. In den meisten Fällen ist nicht rAAV in Wirtsgenome integriert; Somit ist die Gefahr einer unerwünschten genetischen oder genomischen Veränderungen in den Zielzellen gering 22. In jüngster Zeit wurden rAAV - Systeme wurden für die in vivo Abgabe von DNA , die für Proteine, miRNAs, shRNAs und CRISPR-gRNAs in Maus Herzmuskel 23,25-29 erfolgreich eingesetzt. Diese Methodik hat erleichtert grundlegenden Untersuchungen und Gentherapie-Studien auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Forschung. Hier wird die detaillierte Prozedur rAAV9 Vektoren zu erzeugen, die effizient überexprimiert oder die Gene von Interesse in Mäuseherzen Knockdown beschrieben wurde. Das Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode,kardialen Genexpression in murine experimentelle Modelle manipulieren.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimin, linear (MW 25.000)</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen, Polypropylen, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (Menge 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuklease, hochreines</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradientenmedium (Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-100 Membran</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Pipettiernadel für Labors mit 90°; stumpfe Enden, Feinheit 14, L 6 Zoll, vernickelte Nabe</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 Lösung (Pluronic&reg; F-68 Lösung)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenmaschine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugensystem</td><td>Beckman Schar</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 Vektor</td><td>Penn Vektor Kern</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von raav9 überexprimiert oder sturz gene in mäuseherzen

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Steuern der Expression oder Aktivität von spezifischen Genen durch die myokardiale Abgabe von genetischem Material in murinen Modellen ermöglicht die Untersuchung von Gen-Funktionen. Ihr therapeutisches Potential im Herzen kann auch bestimmt werden. Es gibt nur begrenzte Ansätze für in vivo molekulare Intervention in der Maus Herz. Rekombinante Adeno-assoziierten Virus (rAAV) -basierte Genomtechnik wurde als ein wesentliches Instrument für die in - vivo - Herz Genmanipulation verwendet. Die spezifischen Vorteile dieser Technologie sind hohe Effizienz, hohe Spezifität, geringe genomische Integrationsrate, minimal Immunogenität und minimale Pathogenität. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Konstruktion, zur Verpackung und reinigen die rAAV9 Vektoren beschrieben. Subkutane Injektion von rAAV9 in neonatalen Welpen ergibt robust Expression oder effiziente Knockdown des Gens (e) von Interesse in der Maus Herz, aber nicht in der Leber und anderen Geweben. Mit Hilfe der Herz-spezific TNNT2-Promotor, eine hohe Expression von GFP-Gen im Herzen erhalten. Zusätzlich Ziel-mRNA im Herzen gehemmt wurde, wenn ein rAAV9-U6-shRNA genutzt wurde. Kenntnisse im Umgang mit rAAV9 Technologie kann für kardiovaskuläre Untersuchungen nützlich sein.

Die Strategien für die Konstruktion von rAAV9 rAAV9.cTNT :: GFP oder rAAV9.U6 :: shRNA Plasmide sind in den 1 und 2 gezeigt. Wie die Beispiele wurde die rAAV9 Vektor erzeugt, um das GFP-Gen in der Maus Herzen zu überexprimieren. Das resultierende Plasmid enthält das cTnT :: GFP - Kassette flankiert von zwei ITR Stellen (Abbildung 1). Die rAAV9.U6 :: shRNA Vektor wurde konstruiert TRBP mRNA (Figur 2) zu Knockdown <p c...

In diesem Manuskript wird eine Methode zur Herstellung rekombinanter Adeno-assoziierter Virus 9 (rAAV9) Vektoren zur Manipulation der Genexpression im Mausherz beschrieben.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, rekombinantes adeno-assoziiertes Virus vom Typ neun, oder rAAV9, herzustellen, um die Genexpression in Mausherzen zu beeinflussen. Die Methode kann zentrale Fragen auf den Gebieten der Kardiologie und molekularen Genetik beantworten, beispielsweise, wie die Genfunktion im Mausherzen in vivo untersucht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie uns ermöglicht, die Genexpression und -funktion in vivo im Mausherzen einfach zu manipulieren und somit funktionelle Analysen der Genfunktion durchzuführen, ohne auf genetisch modifizierte Tiermodelle angewiesen zu sein.Nachdem rAAV9-Konstrukte hergestellt und HEK293-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, am ersten Tag zur Transfektion der Zellen 70 Mikrogramm AAV-Rep-Cap-Plasmid, 70 Mikrogramm rAAV9-Plasmid und 200 Mikrogramm Ad-Hilfsplasmid in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen kombinieren. 49 Milliliter DMEM ohne FBS mit Raumtemperatur dem Röhrchen zugeben und gut mischen. Anschließend zur Herstellung einer vier-zu-eins-PEI-zu-DNA-Lösung 1.360 Mikroliter PEI zum Röhrchen hinzufügen und gut mischen.Die Lösung 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Quelle: Lu, A., et al. Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und Bewertung des kardialen Arrhythmierisikos. J. Vis. Exp. (2022)Das Video zeigt eine Methode zur Ultraschall-gestützten intramyokardialen Injektion eines rekombinanten viralen Vektors in einem Mausmodell. Diese Technik ermöglicht eine gezielte Gendelivery an das Herz, um die Auswirkungen der Transgenexpression auf die Herzfunktion zu untersuchen.

Virale Gentransfektion im Mausherzen zur Bewertung von Geneffekten auf die Herzfunktion

Quelle: Ding, J., et al. Herstellung von rAAV9 zur Überexpression oder Genabschaltung in Mausherzen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Herstellung rekombinanter adeno-assoziierter Viruspartikel mittels Plasmid-Transfektion in Säugetierzellen. Es verdeutlicht die koordinierte Expression der Rep-, Cap- und Hilfsproteine, die die virale Genomreplikation und die Kapsid-Assembly im Zellkern antreiben.

Erzeugung von rekombinanten adeno-assoziierten Viren durch Plasmid-Transfektion

Quelle: Ding, J. et. al., Herstellung von rAAV9 zur Überexpression oder Herunterregulation von Genen in Mausherzen. J. Vis. Exp. (2016)In diesem Video wird die Reinigung rekombinanter Viruspartikel aus transfizierten menschlichen Nierenzellen gezeigt. Das Virus wird durch Gefrier-Tauch-Lyse freigesetzt und mittels Iodixanol-Gradienten unter Verwendung der Blockcopolymer-unterstützten Filtration gereinigt.

Reinigung rekombinanter Viruspartikel aus transfizierten menschlichen Nierenzellen

In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.

Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Lernen Sie die Herstellung von rAAV9-Vektoren zur Manipulation der Genexpression in Mäuseherzen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien in vivo ohne genetisch modifizierte Tiere.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

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