نموذج وينف - غير مكلفة و تراكتابل مصغر من المخاط توصيل القصبات لدراسة الأحياء الدقيقة من التهابات الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليد بيئة الرئة وتنمية مسببات الأمراض بطريقة أكثر تشابها مع تلك التي تسبب المرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة للمجرى الهوائي مثل كيفية تفاعل مسببات الأمراض البكتيرية المتنوعة في رئة التليف الكيسي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بسهولة التلاعب بالظروف التجريبية.

لمراقبة الاستجابات الميكروبية المشابهة لكيفية حدوثها في الشعب الهوائية الرئوية الفعلية. إظهار الإجراء, سيكون سوف كومستوك من مختبرنا. لتحضير وسط البلغم الاصطناعي ، امزج 16 مل من محلول مخزون المخاط المحضر مسبقا ، ملليلترين من محلول مخزون كلوريد البوتاسيوم ، ملليلترين من محلول مخزون كلوريد الصوديوم ، 200 ميكرولتر من مستحلب صفار البيض ، 5.6 مل من محلول مخزون الحمض النووي ، 120 ميكرولتر من محلول مخزون الفيريتين ، 5.78 مل من محلول الأحماض الأمينية الأساسية ، 5.78 مل من محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 2.44 مل من الماء المعقم.

يعد الإنشاء الدقيق لوسط البلغم الاصطناعي المعقم أمرا في غاية الأهمية. نظرا لأن أي تلوث يمكن أن يغير النشاط البكتيري في الأنابيب الشعرية المحتضنة ، في أسفل الخط. بعد الاهتزاز برفق للخلط ، قم بتقطيع الماصة خمسة ملليلتر من الوسط إلى ثمانية أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 ملليلترا.

يمكن الآن تعديل الوسيط لتحقيق الظروف الكيميائية المرغوبة. على سبيل المثال ، تم تغيير درجة الحموضة في الوسائط المعروضة هنا وإضافة الأصباغ لتعكس حموضتها المختلفة. بعد ذلك ، تحت غطاء حيوي معقم ، أضف 900 ميكرولتر من الوسط إلى كل من ثمانية أنابيب معقمة للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.

قم بتجانس عينات البلغم المكتسبة مسبقا باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لسحب البلغم وإخراجه بشكل متكرر حتى يصبح قوامه سلسا. أضف 100 ميكرولتر من البلغم المتجانس إلى كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الثمانية. ثم دوامة الأنابيب لخلط بما فيه الكفاية.

قم بتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مليلتر وفقا لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة للوسط المعدة مسبقا. ستكون هذه أنابيب الحضانة. استخدم محلول الإيثانول بنسبة 70٪ لتعقيم منشفة ورقية واتركها تجف.

قم بتمزيق المنشفة إلى قطع حوالي أربع بوصات مربعة لكل منها. ثم تنهار قطعة واحدة في قاع كل أنبوب حضانة. مع وجود كتلة واحدة من الورق في الجزء السفلي من كل أنبوب حضانة ، استخدم 1 ملليلتر من الماء المعقم لترطيب كل كتلة قليلا لخلق بيئة رطبة داخل الأنبوب.

لكل أنبوب متوسط ، املأ ثلاثة أنابيب شعرية زجاجية بوسيط عن طريق إمساك أحد طرفي الأنبوب في الوسط وإمالته أفقيا. السماح بعمل الشعيرات الدموية لتوجيه الوسط إلى الأنبوب. أوقف الحشوة عن طريق وضع إصبع مرتدي قفازا برفق على الطرف المفتوح للأنبوب ، ثم أغلق الطرف الآخر من الأنبوب بالضغط عليه لأسفل في كتلة من مانع التسرب المعجون الشعري.

ضع كل مجموعة من ثلاثة أنابيب شعرية في أنابيب حضانة سعة 15 مليلتر ، معجون مغلق لأسفل. ثم قم بتغطية الأنابيب وتأكد من تصنيفها. هذه الأنابيب الشعرية الثلاثة مخصصة لتكرار كل حالة تحكم.

عندما تمتلئ جميع أنابيب الحضانة بأنابيب الشعيرات الدموية المخصصة. ضع الرفوف عند 37 درجة مئوية بحيث يتم احتضان الأنابيب أفقيا حتى لا يهرب أي غاز متولد من خلال الطرف المفتوح. احتضان الأنابيب لمدة 48 ساعة.

قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة مع التأكد من إبقائها أفقية. قم بإخراج الأنابيب الشعرية بعناية من أنابيب الحضانة ، مع إبقاء كل مجموعة من ثلاثة منفصلة عن المجموعات الأخرى. رتب الأنابيب الشعرية بجانب بعضها البعض على صندوق ضوئي مصطف بحيث تكون محتويات الأنابيب مرئية ومضاءة من الأسفل.

نسج فجوة كل ثلاثة أنابيب لفصل الظروف الكيميائية المختلفة بعد ذلك ركز الكاميرا على الأنابيب الموجودة فوقها مباشرة بحيث تكون جميع الأنابيب مرئية في مجال الرؤية ويوفر الضوء من صندوق الضوء تباينا كافيا وتصورا للون أصباغ الأنبوب. لاستخراج محتويات الأنابيب لتحليلها في اتجاه مجرى النهر ، قم بإزالة مجموعة واحدة من الشعيرات الدموية ثلاثية النسخ من صندوق الضوء في كل مرة. أدخل إبرة غير حادة مقاس 25 بوصة مقاس 0.5 بوصة في الطرف المتصل للأنبوب الشعري لكسر الختم.

ثم اقلب الأنبوب الشعري رأسا على عقب للسماح للوسط بالتنقيط من الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 ملليلتر. إذا لم يتساقط الوسيط ، فاستخدم ماصة إلى 200 ميكرولتر لطرد الوسط من الأنبوب عن طريق الضغط لأسفل على مكبس الماصة عند إدخاله في نهاية الأنبوب الشعري. كما هو موضح هنا ، عندما لم تتم إضافة عينات من البلغم إلى الوسط ، كان التغيير الوحيد الذي ظهر عبر طيف الأس الهيدروجيني بعد 48 ساعة من الحضانة هو انخفاض طفيف في الحجم المتوسط الناتج عن التبخر الطفيف.

أظهرت الأنابيب الشعرية الملقحة تغيرات في الحجم ، وظهور فقاعات الغاز ، وتغير اللون ، وظهور رواسب غير شفافة. تظهر هذه النتائج أن البكتيريا والميكروبات الأخرى الموجودة في البلغم المضاف قادرة على النمو والتغير داخل الوسط الاصطناعي. بعد الحضانة ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الأيض وتسلسل الحمض النووي للإجابة على أسئلة إضافية حول سلوك الميكروبات التي تنمو في الأنابيب الشعرية.

نظام winCF هو طريقة جديدة لدراسة نشاط ميكروبيوم الرئة. مهم للعديد من الأمراض بما في ذلك التليف الكيسي ومرض الانسداد الرئوي المزمن والربو وغيرها.