Name: 3 Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Lernen Sie die A-seq2-Methode zur Kartierung von mRNA-3'-Enden und Polyadenylierung. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Genexpression und die Analyse von Transkriptisoformen in verschiedenen Zelltypen.

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Die Autoren danken Frau Béatrice Dimitriades für Hilfe bei der Zellkultur. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung Zuschüsse #31003A_170216 und 51NF40_141735 (NFS RNA &#38; Krankheit).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016).</li>
<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html</a> (2017).</li>
<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li>
<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Vielzahl von Kern und zusätzliche Faktoren, die in der Pre-mRNA 3' Ende Verarbeitung beteiligt sind spiegelt sich in einer entsprechend komplex Polyadenylation Landschaft. Darüber hinaus reagiert Polyadenylation auch zu Veränderungen in anderen Prozessen wie Transkription und Spleißen. 3' Ende Spaltstellen in Pre-mRNAs sind in der Regel identifiziert anhand der charakteristischen poly(A) Schwänzen, die 5'-Spaltprodukte hinzugefügt werden. Die meisten Methoden verwenden oligo(dT) Primer von variabler Länge, mit denen die spezifischen Umwandlung von Poly (A)-mit mRNAs zu cDNAs in einer reversen Transkription Reaktion. Ein häufiges Problem dieses Ansatzes ist interne Grundierung auf A-reiche Sequenzen Serums Spaltstellen führt. Zwei Methoden, die darauf abzielen, dieses Artefakt in der Phase der Vorbereitung der Probe zu umgehen sind vorgeschlagen worden. In den 3P-Seq Methode 1sind Adapter speziell an den Enden von poly(A) Tails mit Hilfe einer Schiene Oligo gefolgt von teilweise RNase T1 Verdauung und reversen Transkription mit TTP in der Reaktion als die einzige Deoxynucleotide ligiert. Die daraus resultierende poly(A)-poly(dT) Heteroduplexes werden dann mit RNase H verdaut und die restlichen RNA-Fragmente isoliert, Adapter ligiert und sequenziert. Ein einfacher und eleganter Methode, 2P-Seq, die verwendet eine benutzerdefinierte Sequenzierung Grundierung überspringen die restliche Strecke der oligo(dT) in der Sequenzierung Reaktion durch die gleichen Autoren 2berichtet wurde. In einer entsprechenden Methode 3' liest 3, eine ungewöhnlich lange Grundierung 5 uns und 45 Ts, auch mit Biotin ist geglüht, fragmentierte RNA, gefolgt von strengen Waschungen für RNA-Moleküle mit poly(A) Schwänzen von mehr als 50 Nukleotiden auswählen. Obwohl 3' liest drastisch die Häufigkeit von internen Priming reduziert, beseitigt es nicht völlig es 3. Protokolle für die direkte RNA Sequenzierung auch vorgeschlagen worden, aber die resultierende liest sind kurz und haben eine hohe Fehlerquote und dieser Ansatz wurde nicht weiter entwickelten 18,19,20. Der PolyA-Seq und kommerzialisierten Quant Seq-Protokolle kombinieren oligo(dT) basierte Grundierung mit einem zufälligen Priming Schritt für die cDNA zweiten Strang Synthese 20. Die Verwendung der Vorlage Schalter reversen Transkription Reaktion mit Moloney Murine Leukämie Virus (MMLV) Reverse Transkriptase führt zu der Generation von cDNAs mit linker in einem einzigen Schritt und damit können keine Adapter-Dimere in der PAS-Seq und SAPAS Methoden erscheinen 21 , 22.
Die A-seq2 Methode hier vorgestellten zeichnet sich in der Nutzung eines spaltbaren Nukleotids (dU) innerhalb einer biotinylierte oligo(dT) Grundierung. Diese Modifikation verbindet das Dienstprogramm oligo(dT) hybridisiert, Polyadenylated Ziele mit der Entfernung von die meisten der Oligo (dT)25 Sequenz aus der isolierte Fragmente bevor Bibliotheken bereit sind und die Erhaltung der drei Ts zu bereichern, zeigen Sie vorherige poly(A) Schwanz. Im Gegensatz dazu lassen Sie Methoden, die RNase H um poly(A) nach dem Zufallsprinzip aus der RNA-Moleküle zu entfernen verwenden mehrere wie. Da im A-seq2, Sequenzierung von 3' Ende der Anti-Sense-Stränge erfolgt, sind Spaltstellen vorhergesagt befindet sich nach dem NNNNTTT Motiv zu Beginn des rohen Sequenz liest. Die randomisierte Tetramers dienen nicht nur Basis, sondern auch bei der Beseitigung von PCR-Amplifikation Artefakte aufrufen lassen. Längere UMIs können auch untergebracht werden. Die Möglichkeit der internen Grundierung bleibt in A-seq2 und richtet sich rechnerisch, zuerst durch verwerfen 3' endet mit einer genomisch kodiert, A-reiche nachgelagerten Sequenz und dann verwerfen 3' Ende Cluster, die durch interne Priming bei erklärt werden könnte die A-reiche poly(A) Signal selbst. Eine aktuelle Analyse von poly(A) Websites abgeleitet eindeutig durch eine Vielzahl von Protokollen zeigt, dass die Websites, die für A-seq2 einzigartig sind die erwarteten Nukleotid Verteilung und Plazierung Gene, ähnlich wie bei anderen 3' Sequenzierung Protokolle zu beenden.
Ein entscheidender Schritt in A-seq2 ist die Auswahl von Polyadenylated RNA und Entfernung der ribosomalen RNAs und verschiedenen kleinen RNAs. Dies geschieht am einfachsten durch eine mRNA-Isolierung-Kit mit Oligo (dT)25 magnetischen Kügelchen. Im Prinzip gibt total RNA isoliert mit Phenol auch Lösungen mit hochwertigen RNA, die weitere Auswahl durch die mRNA-Isolierung Kit oder Oligo (dT) Agarose unterzogen werden kann. Ein Schritt, der in A-seq2 variiert werden kann, ist die Behandlung mit alkalischen Hydrolyse, verkürzt oder verlängert um RNA-Fragmente unterschiedlicher Größe zu erhalten. Kritisch ist auch, dass Zusatz von 3' dATP bis 3' Ende der RNA-Fragmente von poly(A) Polymerase effizient ist. In dem hier beschriebenen Protokoll wird diese Behandlung alle RNA-Fragmente, um Concatemerization während der Ligatur Reaktion zu vermeiden. Endlich, wir beachten Sie, dass obwohl RNA Ligase 1 normalerweise als eine RNA-Ligase verwendet wird, es auch effizient single stranded DNA ligates, wie wir hier getan haben, um einen Adapter, um die 5'-Ende der DNA Moleküle verbinden.
So ist A-seq2 eine effiziente und einfach zu Protokoll für die Identifizierung der Pre-mRNA 3' End-Verarbeitung Websites zu implementieren. Zukünftige Entwicklungen zählen weitere Reduzierung der Komplexität des Protokolls und die Menge des benötigten Materials. Der damit verbundenen Satz von computergestützte Datenanalyse-Tools weiter ermöglichen die homogene Verarbeitung von 3' Ende Sequenzierung liest mit einer Vielzahl von Protokollen erhalten.

Die Erfassung und die Abfolge der mRNA 3' Enden ermöglicht die Untersuchung von mRNA-Verarbeitung und die Quantifizierung der Genexpression. Durch ihren Schwänzen poly(A) können eukaryontischen mRNAs effizient gereinigt werden vom gesamten Zelle Lysates mit Wulst immobilisiert Oligo-Deoxythymidine (oligo(dT))-Moleküle, die auch cDNA Synthese prime kann. Dieser Ansatz hat jedoch zwei Nachteile. Erstens können Strecken von A, die intern für Abschriften sind auch cDNA-Synthese, wodurch falsche poly(A) Websites prime. Zweite, homogene poly(A) Strecken stellen besondere Herausforderungen für die Sequenzierung, abgesehen davon, dass nicht informativ für Abschrift Identifikation. Verschiedene Ansätze wurden vorgeschlagen, diese Einschränkungen, z. B. reverse Transkription durch poly(A) umgehen Schwänzen gefolgt von RNase H Verdauung (3P-Seq 1), verwenden Sie eine benutzerdefinierte Sequenzierung Grundierung endet in 20 Ts (2P-Seq 2), Vorauswahl der RNA-Fragmente mit poly(A) Schwänzen von mehr als 50 Nukleotiden Primer eine CU5T45 gefolgt von RNase H Verdauung (3' liest 3) und die Verwendung von Oligo-dT Grundierung, die den 3'-Adapter in einer Haarnadelkurve (A-Seq 4) enthält.
Die neu entwickelte A-seq2 Methode 5 umgehen Sequenzierung durch poly(A) und gleichzeitig den Anteil der Dimere zu minimieren, die durch selbständige Ligatur der Adapter, besonders auftreten erzeugt werden soll wenn die molare Konzentration der Adapter überwiegt die einfügen-Konzentration. Dieses Problem kann beseitigt werden, wenn beide Adapter auf die gleiche Art von Polynukleotid enden wie in A-seq2 ligiert sind wo die 3'-Adapter, 5'-Ende der RNA-Fragmente und die Adapter 5', 5' Ende der cDNAs nach reversen Transkription ligiert werden. Die Methode ist bequemer als unsere zuvor vorgeschlagene A-Seq - in der Sequenzierung in den 5'-bis-3 wurde ' Richtung damit erfordern präzise gesteuert RNA Fragmentierung-, unter Beibehaltung einer hohen Genauigkeit der Poly-Website-Identifikation. Rund 80 % der sequenzierten lautet in typische Proben des Genoms eindeutig zuordnen und zur Identifizierung von mehr als 20.000 poly(A) Website Clustern, mehr als 70 % der welche Überschneidungen mit kommentierten 3' wo führen.
In Kürze beginnt die A-seq2 Protokoll mit mRNA Fragmentierung und Ligatur der Reverse-Ergänzung 3' Adapter an den 5'-Enden der RNA-Fragmente. Poly (A)-enthaltenden RNAs sind dann umgekehrte transkribiert mit 25 Nukleotide (nt) lang oligo(dT) Grundierung, die einen Anker Nukleotid am 3'-Ende, ein dU an Position 4 und Biotin am 5'-Ende, enthält so dass Bindung der cDNA, magnetische Streptavidin Perlen. Die meisten des Primers, einschließlich Biotin, ist aus der cDNA durch Spaltung an dU durch den Benutzer-Enzym-Mix enthält Uracil DNA Glycosylase (UDG) und der DNA-Glycosylase-Lyase Endonuklease VIII entfernt. Diese Reaktion lässt intakt endet für die Unterbindung der 5'-Adapter und drei Ts links nach Spaltung bleiben um markieren den Standort der Poly-Schwanz. Da 5' und 3'-Adapter durch Unterbindung an Empfänger 5' Enden verbunden sind, sind keine Adapter-Dimere generiert. Vier Nukleotid zufällige-Mers eingeführt Anfang liest ermöglicht Cluster Auflösung auf State-of-the-Art-Sequenzierung Instrumenten und kann auch als einzigartige molekulare Bezeichner (UMI) für die Erkennung und Entfernung von PCR-Amplifikation Artefakten dienen. Die Größe der UMI kann weiter erhöht werden, wie in anderen Studien 6getan. Das Protokoll liest, die Komplementäre mRNA 3' enden, alles beginnt mit einer randomisierten Tetramer, gefolgt von 3 Ts. Verarbeitung der Lesevorgänge, die 3 diagnostische Ts an ihre 5' Ende beginnt mit der Korrektur der PCR-Amplifikation Artefakte durch umkehren werden generiert UMIs, Entfernung von 3' Adapter Sequenzen, Ausnutzung und reverse-Ergänzung. Lesevorgänge, die aus oligo(dT) Grundierung an interne A-reiche Standorten entstanden sein können sind auch rechnerisch ermittelt und verworfen. Die unechten Websites in der Regel fehlt eines der 18 gut charakterisierten und konservierten poly(A) Signale die sollte befindet sich ~ 21 Nukleotide stromaufwärts der scheinbare Spaltung Seite 7.
Das Protokoll erfordert ca. 8 h Handhabungszeit Zellkultur und die Übernachtung grundsätzlich nicht zu zählen. Die damit verbundene lesen Analyse-Software ermöglicht eine hochpräzise poly(A) Website Identifikation. Von der Poly-Website erstellt Cluster basierend auf 4 Proben weiter hervorgehoben, in diesem Manuskript (zwei biologische Wiederholungen der Kontrolle SiRNA und Si-HNRNPC-behandelten Zellen) 84 % Überlappung mit einem kommentierten gen und davon, 75 % Überlappung mit einem 3' UTR und 86 % entweder mit einem 3' UTR oder ein terminal Exon. Der Pearson-Korrelationskoeffizient des Ausdrucks von 3' enden in den Replicate Proben ist 0.92 und Werte von über 0,9 sind in der Regel mit der Methode erhalten. A-seq2 ist somit eine bequeme Methode, die sehr reproduzierbare Ergebnisse liefert.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, hochreines</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin-Triphosphat (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Fläschchen mit geringer Bindung, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green Farbstoff</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>verwenden 1:10.000 Dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 oder NextSeq 500 Sequenzierer der nächsten Generation</td><td>Illumina</td><td>Erkundigen Sie sich beim Lieferanten</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA-Polymerase-Mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-Polymerase, Hefe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-Polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynukleotidkinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Ligase 1, hohe Konzentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>enthält PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse Transkriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td></td><td>Ambion AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzymmischung</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetisches Gestell</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Beheizter Mischer mit beheiztem Deckel</td></tr><tr><td>MicroSpin Säulen</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Hydrolysepuffer, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 Teil 0,1 M Na2CO3 und 9 Teile 0,1 M NaHCO3. Fügen Sie EDTA zu 1 mM hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 9,2 ein. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>5x Poly(A)-Polymerase Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml acetyliertes BSA, 50% Glycerin</td></tr><tr><td>Biotin Bindungspuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&shy; Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1 % NP&shy; 40</td></tr><tr><td>TEN Puffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&shy; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02 % NP&schüchtern; 40</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Sequenz</td></tr><tr><td>Oligonukleotide gemäß Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, für GA-IIx und Hiseq2000/2500 Sequenzierer</td><td><>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&schüchtern; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT Primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A oder C)</td></tr><tr><td>PCR Primer vorne, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>Primer rückseitig, RPI1, Barcode fett gedruckt</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Oligonukleotide gemäß Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, für HiSeq2000/2500 und NextSeq500 Sequenzierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-Amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, RT Primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'PCR</td></tr> <tr><td>Primer forward (D501-506)</td><td>Microsynth oder Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>Primer reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth oder Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Dokumentation</td></tr> <tr><td>für Illumina-Multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' ende sequenzierung bibliothek vorbereitung mit a-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studien in den letzten zehn Jahren haben eine komplexe und dynamische Vielzahl von Pre-mRNA Spaltung und Polyadenylation Reaktionen gezeigt. mRNAs mit langen 3' unübersetzt Regionen (wo) sind in den differenzierten Zellen generiert, während proliferierende Zellen Protokolle mit kurzen 3' wo bevorzugt zum Ausdruck bringen. Wir beschreiben das A-Seq-Protokoll, jetzt in seiner zweiten Version, entwickelte Polyadenylation Websites genomweite abzubilden und die Regulierung der Pre-mRNA 3' End-Verarbeitung zu studieren. Auch nutzt das aktuelle Protokoll die Polyadenylate (poly(A)) Schwänzen, die während der Biogenese der meisten Säugetiere mRNAs für fully-processed mRNAs bereichern hinzugefügt werden. Ein DNA-Adapter mit Deoxyuracil an der vierten Position ermöglicht die präzise Bearbeitung von mRNA 3' Ende Fragmente für die Sequenzierung. Nicht einschließlich der Zellkultur und die Übernachtung grundsätzlich das Protokoll erfordert ca. 8 h Arbeitsaufwand beträgt. Zusammen mit ihm ist eine einfach zu bedienende Software-Paket für die Analyse der Sequenzierungsdaten abgeleiteten zur Verfügung gestellt. A-seq2 und der damit verbundenen Analyse-Software bieten eine effiziente und zuverlässige Lösung für die Zuordnung der Pre-mRNA 3' endet in einer Vielzahl von Bedingungen von 106 oder weniger Zellen.

Poly (A)-mit RNA wurde von kultivierten Zellen, fragmentiert durch alkalische Hydrolyse isoliert und cDNAs wurden durch reverse Transkription mit oligo(dT) Primer. Die daraus resultierende cDNA wurde auf Streptavidin Perlen immobilisiert, dU war gespalten in Uracil spezifische Exzision Reaktion, Adapter wurden ligiert, 5' und 3' Enden gespalten Fragment und die Einsätze wurden sequenziert. Abbildung 1 zeigt eine grafische Übersicht über das Experiment.
Für HeLa und HEK293 Zellen reichten 106 Zellen poly(A) Standorte für die überwiegende Mehrheit der Protein-kodierenden Gene am Ende des Verfahrens. Allerdings erhöht sich für andere Arten von Zellen oder Gewebe, die es möglicherweise erforderlich, die Sättigung als die Anzahl der Zellen in das Experiment in die Anzahl der identifizierten poly(A) Websites testen. Repräsentative Ergebnisse der pilot PCR Schritt und des DNA-Fragments Analyse der Probe vor der Sequenzierung in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 3 zeigt die Vorverarbeitung Schritte für die computergestützte Analyse ausgehend von der Fastq-Datei aus der Sequencer und endend mit der Qualität überprüft, Adapter-getrimmten liest, die bereit sind, das Genom zugeordnet werden. Abbildung 4 zeigt die Analyseschritte, die beginnen mit der Zuordnung der Lesevorgänge zu den entsprechenden Genom und das Ende mit dem Katalog von mRNA 3' End-Verarbeitung von Websites, die in einer bestimmten Probe identifiziert werden. Wenn mehrere Proben analysiert werden, sind zusätzliche Schritte entspricht dem 3' Ende Verarbeitung von Websites, die in einzelnen Proben gefunden wurden und melden ihre Fülle über Proben durchgeführt. Diese Schritte werden in Abbildung 5dargestellt.
So, nachdem Proben sequenziert haben, ist die Analyse der resultierenden Sequenzierung Dateien (im Fastq-Format) durch die verfügbaren Verarbeitungspipeline zu lesen einfach. Nach dem Hinzufügen der Informationen über die Proben in die Konfigurationsdatei, die Ausführung der Pipeline wird in zwei Haupttypen von Ausgabedateien führen: 1) Bett-Dateien mit allen 3' Ende Verarbeitung Standorte in einzelnen Proben (z. B. " sample1.3pSites.noIP.Bed.gz"), und 2) eine Bett-Datei mit allen poly(A) Website Clustern (clusters.merged.bed) über alle Proben der Studie. Die Ausgabe enthält auch die Genom-Koordinaten für alle Lesevorgänge aus jeder einzelnen Probe (z.B. "Beispiel1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.BAM"), die später in einem Genom-Browser wie IGV16eingesehen werden können. Sichtprüfung der lesen Sie Firmenprofile bietet im Allgemeinen einen ersten Blick auf die Verteilung der Poly-Standorte in das Genom und die Veränderungen, die auf die spezifischen Störungen auftreten, die in der Studie durchgeführt wurden. Zum Beispiel ist in Abbildung 6 die Reaktion eines bestimmten Gens auf der Knock-down des HNRNPC Proteins dargestellt.
Zusammenfassungen dieser genomweiten Distributionen sind ebenfalls vorhanden (Tabelle 1). Im einzelnen enthalten Output-Dateien im Verzeichnis "zählt/Annotation_overlap" Bruchteile von Websites, die mit kommentierten Besonderheiten überlappen (aus der Gtf-Datei als Eingabe bereitgestellt; beschriftet sind: 3' UTR, terminal Exon Exon, Intron, intergenetischer). Zu guter Letzt werden Ergebnisse der einzelnen Bearbeitungsschritte für jede Probe auch (z. B. "sample1.summary.tsv") gespeichert. Hierunter fallen die Zahlen: roh liest in jeder Probe, liest, die die erwartete Struktur der 5'-Ende, mal gelesen, die nach einem Zusammenbruch vollständige PCR Duplikate bleiben, qualitativ hochwertige liest nach den Kriterien definiert bei Schritt 9.2, liest die Karte eindeutig auf das Genom (nach einem Zusammenbruch diejenigen, die durch Sequenzierung Fehler geführt, siehe Schritt 9,5), Multi-Mapping liest (nach einem Zusammenbruch diejenigen, die durch Sequenzierung Fehler geführt, siehe Schritt 9,5), roh (nicht geclusterten) 3' End-Verarbeitung Websites in jeder Probe, roh 3' End-Verarbeitung Websites ohne interne Priming Kandidaten enden einzigartige 3' Verarbeitung Websites aus allen Proben ohne interne Priming Kandidaten und abschließende Reihe von Poly-Website-Cluster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: Main Schritte des Protokolls A-seq2. Einzelnen Schritte sind auf der linken Seite der Abbildung angegeben. Insert-RNA-Fragmente sind als grüne Linien dargestellt, die nach der reversen Transkription für cDNA rot; Adapter sind in hellem Blau oder Orange gefärbt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Pilot PCR und endgültige Produktprofil. (ein) Aliquote aus der PCR-Reaktion wurden bei verschiedenen Zyklen gesammelt und getrennt auf 2 % Agarose-Gele. Zahlen auf der linken Seite geben Größe in Nukleotide der jeweiligen Bands in der DNA-Leiter. In diesem Experiment wurden 12 Zyklen (*) für die groß angelegte PCR Reaktion ausgewählt. (b) Beispiel einer Stichprobe nach Größe Auswahl führen Sie auf einem Fragment Größe Analysator enthüllt eine durchschnittliche Größe von rund 280 Nukleotiden. Zahlen auf der linken Seite [FU] relative Signalintensität. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Übersicht über die Vorverarbeitung der Sequenzierung liest. Die Fastq-Dateien mit liest, die von der Sequenzierung Instrument-assoziierten Software generiert werden werden verarbeitet, um qualitativ hochwertige liest zu identifizieren, die das entsprechende Genom zugeordnet werden kann. Die Abbildung zeigt die input-/Output-Spezifikation der einzelnen Schritte in der Pipeline, mit Links zu den einzelnen Schritten des Protokolls beschrieben im Abschnitt "Datenverarbeitung". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Gliederung der Reihenfolge lesen Verarbeitung, aus dem Schritt des Mappings in das Genom der Generation der einzelnen 3' Ende Verarbeitung Websites. Die Abbildung zeigt die input-/Output-Spezifikation der einzelnen Schritte in der Pipeline, mit Links zu den igerne Schritte des Protokolls, die im Abschnitt "Datenverarbeitung" beschrieben. Die wichtigsten Ausgabedatei, die an den Benutzer übermittelt wird, ist fett markiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Übersicht über die Schritte, die ergriffen werden, um Gruppen von Co geregelten 3' Ende Sequenzierung Websites generieren. Die Abbildung zeigt die input-/Output-Spezifikation der einzelnen Schritte in der Pipeline, mit Links zu den einzelnen Schritten des Protokolls beschrieben im Abschnitt "Datenverarbeitung". Die wichtigsten Ausgabedatei ist fett markiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Beispiel-Ergebnisse des Profils der 3' Ende Verarbeitung liest entlang der terminal Exon des Gens NUP214, gezeigt in der IGV 16 Genom Browser. A-seq2 liest wurden aus zwei Proben von HEK-293-Zellen, behandelt mit einer Kontrolle-SiRNA oder mit einem HNRNPC SiRNA vorbereitet. Die Lesevorgänge, die Poly-Websites dokumentiert, die von der Pipeline Analyse kommentiert wurden waren im BAM-Format gespeichert, die als Eingabe für den IGV-Genom-Browser verwendet wurde. Die 3' Enden der lesen Sie Gipfel zuordnen mRNA 3' enden, die in Ensembl versehen sind. Die Profile zeigen eine verstärkte Nutzung der langen 3' UTR Isoform auf HNRNPC zerlegbar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Si-Control replizieren 1</td>
			<td>Si-Control replizieren 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der Roh-Lesevorgänge</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der gültigen liest nach dem Trimmen und Filterung</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der eindeutigen Zuordnung mal gelesen</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der Lesevorgänge, die Zuordnung zu mehreren loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der einzelnen 3' End-Verarbeitung Websites</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Beispielausgabe der Pipeline Analyse. Zusammenfassungen der Lesevorgänge, die einzelnen Schritte erzielt wurden.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Zuordnung Pre-mRNA 3' End-Verarbeitung Websites.

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mRNA-3'-Enden zu erfassen und zu sequenzieren, wodurch Untersuchungen zur mRNA-Verarbeitung, insbesondere zur Spaltung am 3'-Ende und zur Polyadenylierung, sowie die Quantifizierung der Genexpression ermöglicht werden. Das hier vorgestellte A-seq2-Protokoll und das dazugehörige Datenanalysepaket können dabei helfen, zentrale Fragen zur Entstehung und Funktion von Transkript-Isoformen in verschiedenen Zelltypen und Geweben zu beantworten. Die wichtigsten Vorteile der A-seq2-Methode liegen darin, dass sie das Sequenzieren langer poly(A)-Strecken vermeidet und keine Adapter-Dimeren erzeugt.Zellen, die bis zu 80 % Konfluenz kultiviert wurden, werden für dieses Verfahren verwendet. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Lyse die Zellen direkt auf der Platte, indem Sie je Vertiefung ein Milliliter Lysepuffer hinzufügen und mit einem Gummispachtel das Zellmaterial vollständig von der Plattenoberfläche ablösen.Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um das viskose Lysat aus jedem Well in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen zu überführen. Verteilen Sie die DNA mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die an eine 23-Gauge-Hypodermikanadel angeschlossen ist. Führen Sie mehrere kräftige Auf- und Ab-Bewegungen des Kolbens durch, bis das Lysat nicht mehr viskos ist.Überführen Sie das Lysat in eine 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g und 4 °C für fünf Minuten, um den Zelltrümmern zu entfernen. Sammeln Sie das klare Überstand vom Lysat auf.Zu Oligo-d(T)25-Magnetkugeln hinzufügen und das Gemisch resuspendieren. Die Röhrchen 10 Minuten lang auf ein Rotationsgerät stellen. Danach die Röhrchen zwei Minuten lang auf einen Magnetrack stellen.Entfernen Sie die klare Flüssigkeit. Geben Sie 0,8 Milliliter Puffer A zu jedem Röhrchen hinzu und drehen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal um 180 Grad. Entfernen Sie Puffer A aus der zweiten Wäsche.Fügen Sie 0,8 Milliliter Puffer B zu jedem Röhrchen hinzu und lassen Sie es zwei Minuten lang im Rack stehen. Um die gebundene mRNA von den Perlen zu eluieren, entfernen Sie Puffer B, geben Sie 33 Mikroliter Wasser zu jedem Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. Erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 75 Grad Celsius in einem beheizten Block. Die Röhrchen sofort für eine Sekunde kurz zentrifugieren und auf den Magnetständer stellen. Den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. 66 Mikroliter alkalische Hydrolysepuffer zu jedem Röhrchen hinzufügen, mischen und genau fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius auf einem Heizblock erhitzen.Kühlen Sie die Röhrchen unverzüglich auf Eis. Führen Sie anschließend die RNA-Isolierung mit einem RNA-Reinigungskit gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie jeder RNA-Probe 14 µL eines Polynukleotidkinase-Master-Mix hinzufügen.Ansatz bei 37 Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren. Nach 30 Minuten die Kinase-Reaktionen auf vorbereitete Spin-Säulen überführen. Die Säulen zwei Minuten lang bei 735 × g zentrifugieren.Entfernen Sie die Säulen und stellen Sie die Röhrchen mit den gesammelten Reaktionen auf Eis. Um die drei Enden der RNA-Fragmente zu blockieren und deren Concatamerisierung in nachfolgenden Ligationsreaktionen zu verhindern, geben Sie zu jeder Probe 17,5 µL einer Poly(A)-Polymerase-Master-Mix-Lösung hinzu. Mischen und kurz (eine Sekunde) zentrifugieren.Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten jeweils 32,5 Mikroliter Wasser zu den Reaktionen hinzufügen und die RNA gemäß der schriftlichen Protokollanleitung aufreinigen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Reaktionen zur Volumenreduktion auf sechs Mikroliter zehn Minuten lang in einen Vakuumkonzentrator geben.Fügen Sie dann jeder Reaktion 24 Mikroliter einer RNA-Ligase-Master-Mix-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen 16 Stunden lang in einem temperierten Mischgerät bei 24 Grad Celsius mit intermittierendem Mischen bei eintausend U/min. Fügen Sie am folgenden Tag 17 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion hinzu und mischen Sie gut durch.Reinigen Sie die RNA gemäß der schriftlichen Anleitung. Stellen Sie die Eluate drei Minuten lang in einen Vakuumkonzentrator, um das Volumen auf 11 Mikroliter zu reduzieren. Überführen Sie die Ansätze in 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen für die Reverse Transkription.Fügen Sie ein Mikroliter Primer hinzu. Erhitzen Sie fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius in einem PCR-Cycler und lassen Sie anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Geben Sie acht Mikroliter einer reversen Transkriptions-Master-Mix-Lösung zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und mischen Sie gut. Stellen Sie die Röhrchen in einen PCR-Cycler. Erwärmen Sie sie 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius und anschließend weitere 10 Minuten auf 80 Grad Celsius. Danach auf Eis stellen.Streptavidin-Perlen gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereiten. Die Reverse-Transkriptionsreaktion zur Perlenlösung hinzufügen und 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubieren. Die Perlen mithilfe eines Magnetracks zweimal mit Biotin-Bindungspuffer und zweimal mit TEN-Puffer waschen.Suspendieren Sie die Kügelchen in 50 µL TEN-Puffer. Geben Sie zwei µL Uracil-DNA-Glykosylase-Enzymgemisch hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 °C in einem Mischer mit intermittierendem Mischen. Geben Sie 50 µL Wasser, 11 µL RNase-H-Puffer und ein µL RNase H zu jeder Reaktion hinzu.Ansatz bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Die Röhrchen auf den Magnetständer stellen und die Flüssigkeit, die die gespaltene cDNA enthält, in ein neues Röhrchen übertragen. Die gespaltene cDNA mithilfe eines PCR-Reinigungskits gemäß der schriftlichen Anleitung reinigen.Stellen Sie die gereinigte cDNA acht Minuten lang in einen Vakuumkonzentrator, um sie auf ein Volumen von sieben Mikrolitern einzukonzentrieren. Um fünf-Prime-Adapter an die fünf-Prime-Enden der isolierten cDNA anzuligieren, geben Sie zu jeder Probe 23 Mikroliter einer RNA-Ligase-Master-Mix-Lösung hinzu und inkubieren bei 24 Grad Celsius für 20 Stunden. Abschließend geben Sie 70 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion hinzu.Ein Pilot-PCR-Lauf wird durchgeführt, um die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für die Amplifikation der Bibliothek in der exponentiellen Phase zu bestimmen. Geben Sie Folgendes in eine 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen pipettieren: 25 Mikroliter DNA-Polymerase-Mix, 20 Mikroliter Ligationsreaktion, zwei Mikroliter Wasser, 1,5 Mikroliter Vorwärts-PCR-Primer und 1,5 Mikroliter Rückwärts-PCR-Index-Primer. Führen Sie den Cycler mit folgendem Programm durch: drei Minuten bei 95 °C, gefolgt von 20 Zyklen mit jeweils 20 Sekunden bei 98 °C, 20 Sekunden bei 67 °C und 30 Sekunden bei 72 °C.Sammeln Sie sieben Mikroliter-Aliquots direkt vom Thermocycler nach den angegebenen Zyklen. Trennen Sie die Produkte in einem 2 %igen Agarosegel und visualisieren Sie die Migration der PCR-Produkte. Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen zu Beginn der exponentiellen Amplifikation – in diesem Beispiel 12 Zyklen – und verwenden Sie diese Zyklenanzahl für eine PCR-Reaktion im größeren Maßstab.Trennen Sie die Produkte aus der groß angelegten PCR-Reaktion in einem 2 %igen Agarosegel auf und schneiden Sie die Geleinschnitte mit DNA-Produkten von 200 bis 350 Nukleotiden heraus. Extrahieren Sie anschließend die DNA aus den Geleinschnitten mithilfe des Gel-Extraktionskits, wie im textbasierten Protokoll beschrieben. In diesem Video werden nur die wichtigsten computergestützten Schritte gezeigt.Weitere Einzelheiten sind im Textprotokoll verfügbar. Klonen Sie zunächst das Git-Repository und wechseln Sie in das neu erstellte Verzeichnis. Erstellen Sie eine Umgebung, die die Software enthält, und aktivieren Sie diese Umgebung.Laden Sie die Genomsequenz des Organismus herunter, aus dem die A-seq2-Daten gewonnen wurden. Öffnen Sie die Konfigurationsdatei und stellen Sie die Eingabeparameter gemäß dem Textprotokoll ein. Starten Sie die Analyse.Die Reaktion eines spezifischen Gens, NUP214, auf die Herunterregulation des HNRNPC-Proteins, wurde durch die Analyse von a-seq2-Lesungen aus zwei Proben von HEK-293-Zellen untersucht, die entweder mit einer Kontroll-siRNA oder mit einer HNRNPC-siRNA behandelt wurden. Die Lesungen, die poly(A)-Stellen dokumentierten, die durch die Analyse-Pipeline annotiert wurden, wurden im BAM-Format gespeichert und als Eingabe für den IGD-Genombrowser verwendet. Die drei-Enden der Lese-Peaks wurden an den drei-Enden von mMRNA kartiert, die in Ensemble annotiert sind.Die Profile zeigen eine stärkere Nutzung der langen dreifachen 3'-UTR-Isoform nach HNRNCR-Knockdown an. Wenn man die A-seq-Methode beherrscht, benötigt man acht Stunden praktische Arbeitszeit oder etwa zwei bis drei Tage, ohne die Zeit für die Zellkultur und die Übernacht-Ligationen einzubeziehen. Bei der Durchführung des Protokolls ist es wichtig, zunächst einen primären Satz zu entwerfen, der den am jeweiligen Standort verwendeten Sequenzierungsplattformen entspricht.Nachdem Sie die 3'-Enden von mMRA erhalten haben, können andere Methoden wie Vernetzung und Immunpräzipitation durchgeführt werden, um Regulatoren der 3'-Endverarbeitung von prä-mRNA zu identifizieren. A-seq2 ebnete den Forschern auf dem Gebiet der RNA-Verarbeitung den Weg, um die Regulation und die Folgen der alternativen Polyadenylierung in einzelnen Zelltypen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bibliotheken von mRNA-3'-Enden erzeugt, die Sequenzierungsdaten analysiert, neue Poly(A)-Stellen identifiziert und deren Nutzung quantifiziert.Wir hoffen, dass A-seq2 Ihre Arbeit beim Erforschen der Regulation der mRNA-Verarbeitung vereinfacht und zu vielen neuen Erkenntnissen führt.

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

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