Name: Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Aprende a monitorear ensamblajes transitorios de chaperonas J-domain y Hsp70 en bacterias, levaduras y células humanas mediante ensayo de ligación de proximidad in situ. Esta técnica revela dinámicas de proteostasis celular.

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NBN cuenta con el apoyo de una beca especial de reclutamiento de la Facultad de Enfermería de medicina y ciencias de la salud de la Universidad de Monash con financiación del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia. Agradecemos a Bernd Bukau (ZMBH, Universidad de Heidelberg, Alemania) y Harm H. Kampinga (Departamento de Ciencias Biomédicas de Células y Sistemas, Universidad de Groningen, Países Bajos) por su inestimable apoyo y intercambio de reactivos, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universidad de Heidelberg, Alemania) por su apoyo con la microscopía confocal y el procesamiento de imágenes, y Claire Hirst (ARMI, Universidad de Monash, Australia) para la lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de células HeLa
<ol><li>Preparar los siguientes materiales: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, complementado con 10% FCS y 1% Pen-Strep; 4% paraformaldehyde en PBS; 0.5% Tritón-X100 en PBS; TBS-T (150 mM NaCl, Tris de 20 mM, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% solución estéril de poli-L-lisina; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda; papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin. NOTA: Para garantizar una eficiencia óptima de fijación, las soluciones de paraformaldehído deben prepararse frescas antes de cada experimento.</li>
	<li>Prepare una cámara húmeda cubriendo la parte inferior de una caja cerrada con tejidos húmedos. Colocar la cámara húmeda a 37oC antes de iniciar el experimento, para asegurarqueque que la temperatura de la cámara esté a 37oC mientras incuba las reacciones enzimáticas.</li>
	<li>Células HeLa de cultivo en matraces T25, en 5 mL de DMEM (alta glucosa, glutamato y piruvato sódico suplementado) suplementadas con 10% FCS y 1% Pen-Strep, en una incubadora de CO2 de 37oC que contiene 5% CO2. Disociar las células adherentes usando 0.05% Trippsin-EDTA. Después de la adición de DMEM fresco a las células disociadas, contar las células usando una cámara de conteo celular y crecer en diapositivas de diagnóstico dentro de una cámara húmeda.</li>
	<li>Esterilice las diapositivas de diagnóstico por irradiación UV en una campana de cultivo celular estéril durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 100 l de estéril filtrado 0.0001% poli-L-lisina a cada pocedés necesario para el experimento. Incubar durante 30 min. Lavar el exceso de poli-L-lisina lavando cada pozo 3x con 50 s de agua ultrapura.</li>
	<li>Intenta tapizar las células de HeLa y agrega aproximadamente 15.000 células a cada pocal. Si es necesario, diluir las células a por lo menos 30-50 l de DMEM por poca.</li>
	<li>Cultivar células en una cámara húmeda dentro de una incubadora de CO2 de 37oC al 5% durante aproximadamente 24 h. Las células deben ser de entre 60% y 80% de confluente antes de iniciar el PLA. NOTA: Una confluencia demasiado alta disminuye la absorción de los reactivos, disminuyendo la señal obtenida al final del protocolo.</li>
	<li>Retire el medio colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lavar los pozos 3 veces con 50 oL de PBS. NOTA: Las células están sujetas a desprendimiento cuando los líquidos se añaden con dureza. Esto se puede prevenir al no dejar que los pozos se sequen por completo antes de añadir nuevo líquido y añadiendo el nuevo líquido suavemente al borde del pozo.</li>
	<li>Arreglar las células agregando 50 sL de paraformaldehído del 4% recién preparado en PBS a cada poca. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los portaobjetos 3x en PBS. Realice lavados en un frasco de manchas deslizantes de Coplín que contenga 100 ml de PBS. Para cada lavado, incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitar.</li>
	<li>Permeabilizar la membrana celular sumergiendo las diapositivas en 100 ml de 0.5% Triton-X100 en PBS en un frasco de tinción deslizante Coplin. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente sin agitar.</li>
	<li>Lave los portaobjetos 3 veces en TBS-T. Realice lavados en un frasco de manchas deslizantes de Coplin que contenga 100 ml de TBS-T. Para cada lavado, incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitar.</li>
	<li>Después del último lavado, retire el exceso de tampón con un papel tisú. En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.</li>
</ol>2. Preparación celular de S. cerevisiae
<ol><li>Preparar los siguientes materiales: 100 mM KPO4,pH 6.5, conocido como Wash Buffer; 37% de formaldehido; 4% paraformaldehyde en 100 mM KPO4, pH 6.5; 1.2 M sorbitol en 100 mM KPO4, pH 6.5; solución de liticasa (500 g/ml de liticasa, 20 mM demercaptoetanol, 100 mM de KPO 4, pH 6,5); 0.0001% solución de poli-L-lisina; 1% Tritón-X100 en 100 mM KPO4, pH 6.5; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda (preparada como en el paso 1.2); papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin. NOTA: Para garantizar una eficiencia óptima de fijación, las soluciones de paraformaldehído deben prepararse frescas antes de cada experimento.</li>
	<li>Cultivar un cultivo nocturno en extracto de levadura no selectivo, peptona y dextrosa (YPD) medio a 30 oC mientras se agita. NOTA: Dependiendo de los requisitos experimentales S. cerevisiae células se pueden cultivar en sintético completo (SC) medio o selectivo sintético mínimo (SM) medio en su lugar.</li>
	<li>Diluir el cultivo estacionario a una Do6600 de 0,1 en un medio de 20 ml. Cultivar las células a 30 oC mientras se agita hasta que el OD600 alcanza 0,5.</li>
	<li>Transfiera el cultivo de 20 ml a un tubo centrífugo de 50 ml. Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspender las células en 5 ml de medio fresco.</li>
	<li>Corrija las celdas agregando 550 sL de 37% de formaldehído al cultivo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 1 ml de paraformaldehído al 4% recién preparado en Wash Buffer. Incubar durante 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Durante la incubación, preparar las diapositivas de diagnóstico mediante la adición de 100 l de 0.01% solución de poli-L-lisina a cada pozo. Incubar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 30 minutos, lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. Los portaobjetos secos están listos para su uso.</li>
	<li>Lave las células dos veces con 1 ml de Wash Buffer. Realice lavados centrifugación de las células a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en Wash Buffer.</li>
	<li>Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 ml de sorbitol de 1,2 M en Wash Buffer.</li>
	<li>Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 250 ml de solución de litica recién preparada para digerir la pared celular. Incubar las células en la solución de Lyticase durante 15 min a 30 oC mientras agita.</li>
	<li>Después de la digestión, lavar las células 3 veces por centrifugación a 665 x g durante 3 min y eliminar el sobrenadante. Resuspenda las células en 250 ml de sorbitol de 1,2 M en Wash Buffer. NOTA: Debido a que las células son frágiles después de la digestión de la pared celular, resuspenderlas con mucho cuidado para no dañar las células.</li>
	<li>Añadir 20 l de células resuspendidas a las diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. Permítales fijarlos a las diapositivas durante 30 minutos. Lavar las células no adherentes lavando los pozos 3x con 50 l de wash Buffer.</li>
	<li>Permeabilizar la membrana celular lavando 3x con 50 éL de 1% Triton-X en Wash Buffer. NOTA: En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.</li>
</ol>3. Preparación celular de E. coli
<ol><li>Preparar los siguientes materiales: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; solución de lisozyme (2 mg/ml de lisozima, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM Glucosa, 10 mM EDTA); 0.0001% solución de poli-L-lisina; 99% metanol helado; 99% metanol a temperatura ambiente; 99% acetona; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda (preparada como en el paso 1.1.1); papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin.</li>
	<li>Cultivar un cultivo nocturno en Luria-Bertani (LB) medio a 30 oC mientras tiembla.</li>
	<li>Diluir el cultivo estacionario a una OD600 de 0.02 en medio LB fresco. Cultivar las células a 30 oC mientras se agita hasta que el OD600 alcanza 0,4 para las células de fase de registro.</li>
	<li>Aproximadamente 15 minutos antes de que las células alcancen una DoT600 de 0.4, prepare diapositivas recubiertas de poli-L-lisina agregando 100 sL de 0.0001% poli-L-lisina a cada poca. Incubar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 30 minutos lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. Los portaobjetos secos están listos para su uso.</li>
	<li>Cuando las células alcancen una DoT600 de 0,4, transfiera 1 ml del cultivo a un tubo de microcentrífuga estéril y a células de pellets a 2.650 x g durante 2 min.</li>
	<li>Resuspenda las células en un medio de 50 oL de LB.</li>
	<li>Fije las células añadiendo 1 ml de metanol 99% helado. Mezclar muy suavemente a mano. Incubar células durante 30 min a -20 oC.</li>
	<li>Después de la fijación añadir 20 l de las células a las diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 50 l de solución de lisozyme recién preparada a cada pocto para digerir la pared celular. Incubar en una cámara húmeda durante 30 min a 25oC.</li>
	<li>Retire la solución de lisozyme de los pozos añadiendo un papel tisú al borde del pozo. Lave los portaobjetos 3x en 100 mL de PBS-T. Realice cada lavado en un frasco de manchas deslizantes de Coplin durante 30 s, sin agitar.</li>
	<li>Retire el tampón de lavado de las diapositivas tocando las diapositivas en un papel tisú.</li>
	<li>Permeabilizar las membranas celulares mediante la adición de 50 l de metanol 99% a cada poca. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el metanol colocando un papel tisú en el borde del pozo.</li>
	<li>Añadir 50 s l de acetona del 99% a cada poca. Incubar durante 1 min.</li>
	<li>Retire el exceso de acetona colocando un papel tisú en el borde del pozo. Deje que los portaobjetos se sequen al aire. En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.</li>
</ol>4. Ensayo de ligadura de proximidad
<ol><li>Preparar los siguientes materiales: Zona de influencia de bloqueo; Búfer de dilución de anticuerpos; Búfer de lavado 'A' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Búfer de lavado 'B' – (Tris de 200 mM, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-Rabbit Secondary Anticuerpo PLUS; Anti-Mouse Secondary Anticuerpo MINUS; 5x Tampón de Ligación; ligasa; 5x Tampón de Amplificación (Naranja:ex 554 nm; áem 576 nm); polimerasa; agua ultrapura; y medio de montaje que contiene DAPI. NOTA: Los reactivos de detección de PLA también están disponibles en las variantes Verde (por ejemplo, 495 nm;a em 527 nm), Rojo (ex 594 nm; áem 624 nm), FarRed (ex 644 nm;á em 669 nm) o Brightfield (peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado).</li>
	<li>Bloquee las celdas agregando una gota de búfer de bloqueo a cada pozo. Incubar durante 30 min a 37oC en una cámara húmeda.</li>
	<li>Preparar soluciones de anticuerpos diluyendo anticuerpos en stock en El tampón de dilución de anticuerpos. Para cada pocil se requieren 40 l de solución de anticuerpos.</li>
	<li>Retire el tampón de bloqueo colocando un papel tisú en el borde del pozo. Añadir 40 l de anticuerpo diluido en el tampón de dilución de anticuerpos a cada poca. Incubar durante 60 minutos en una cámara húmeda a 37oC o durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Retire la solución de anticuerpos de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 5 min, sin agitar.</li>
	<li>Durante los pasos de lavado, diluir 5 x sondas secundarias de anticuerpos, anticonejo PLUS y anti-ratón MINUS (la especificidad de la especie de las sondas depende de los anticuerpos primarios utilizados), en Tampón de Dilución de Anticuerpos. Preparar 40 ml de solución de anticuerpos por poca.</li>
	<li>Añadir 40 s de solución de anticuerpos secundarios a cada poca. Incubar durante 60 min a 37oC en cámara húmeda.</li>
	<li>Retire la solución secundaria de anticuerpos de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 5 min, sin agitar.</li>
	<li>Durante los lavados se preparan 40 ml de mezcla de ligadura por poca, mezclando 8 ml de tampón de ligadura 5x, 31 ml de agua ultrapura y 1 l de ligasa.</li>
	<li>Añadir 40 s de mezcla de ligadura a cada poca. Incubar durante 30 min a 37oC en una cámara húmeda.</li>
	<li>Retire la mezcla de ligadura de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 2 min, sin agitar.</li>
	<li>Durante los lavados, preparar 40 ml de mezcla de amplificación por poca, mezclando 8 ml de solución de amplificación de 5x, 31,5 ml de agua ultrapura y 0,5 ml de polimerasa. NOTA: La amplificación 5x contiene sondas fluorescentes. Proteja esta mezcla de la luz. Además, proteja las diapositivas de la luz durante cada uno de los siguientes pasos. Si utiliza frascos de manchas deslizantes de Coplin translúcidos y cámaras húmedas, envuélvalos en papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir 40 s de mezcla de amplificación por poca. Incubar durante 100 min a 37oC en una cámara húmeda.</li>
	<li>Retire la mezcla de amplificación de los polos. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'B' en un frasco de tinción deslizante coplin durante 10 minutos sin agitar.</li>
	<li>Lave los portaobjetos en 100 ml de Wash Buffer 'B' diluido 1:100 en agua ultrapura en un frasco de tinción deslizante Coplin durante 30 s.</li>
	<li>Añadir 20 s de DAPI que contenga medio de montaje por pozo a las diapositivas. Cierre las diapositivas con un cubreobjetos y cierre las diapositivas con esmalte de uñas.</li>
	<li>Si toma imágenes, incubar inmediatamente DAPI que contenga medio de montaje durante 10-15 min, mientras esté protegido de la luz. Si no es así, guarde las diapositivas a -20 oC durante un máximo de 1 semana, protegidas de la luz.</li>
</ol>5. Detección
<ol><li>Utilice la microscopía confocal para adquirir imágenes de las células HeLa, S. cerevisiae y E. coli con objetivos de Apochromat de plan 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA y 100x/1.4 NA Plan Apochromat, respectivamente. Emocione dAPI manchado de ADN con un láser de diodo pulsado de 405 nm. Para la señal PLA (para este estudio) excitar con un láser de estado sólido de 561 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Los enfoques basados en la co-inmunoprecipitación y la colocalización se han utilizado como métodos de larga data para caracterizar los ensambladores de proteínas. La detección de complejos de chaperona específicos formados transitoriamente es un desafío importante con estos métodos convencionales, y como resultado, los hallazgos anteriores se limitan en gran medida a interpretaciones cualitativas. Las técnicas de coinmunoprecipitación basadas en lisis celular a menudo requieren reticulación para estabilizar las interacc...

Una gran cantidad de información genómica sigue siendo ininterpretable debido a nuestra comprensión incompleta de los interactomes celulares. Las metodologías convencionales de detección de interacciones proteína-proteína, como la coinmunoprecipitación proteína con/sin reticulación química y la colocalización proteica, aunque ampliamente utilizadas, plantean una serie de desventajas. Algunas de las principales desventajas incluyen la cuantificación deficiente de las interacciones y la posible introducción de eventos de enlace no nativos. En comparación, las técnicas emergentes basadas en proximidad proporcionan una alternativa y un enfoque potente para capturar interacciones proteicas en las células. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA)1, ahora disponible como un kit patentado, emplea anticuerpos para apuntar específicamente a los complejos proteicos en función de la proximidad de las subunidades que interactúan.
El PLA se inicia mediante la formación de un andamio que consiste en anticuerpos primarios y secundarios conpequeñas etiquetas de ADN (sondas PLA) en la superficie del complejo proteico objetivo (Figura 1, pasos 1-3). A continuación, determinada por la proximidad de las etiquetas de ADN, se genera una moléculade ADN circular a través de la hibridación con oligonucleótidos conectores (Figura 1, paso 4). La formación del ADN circular se completa con un paso de ligadura de ADN. La pieza circular de ADN (PCR) recién formada sirve como plantilla para la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en amplificación de círculo rodante (RCA) cebada por una de las etiquetas de oligonucleótidos conjugadas. Esto genera una molécula de ADN concatemérica de una sola cadena unidaal complejo proteico a través del andamio de anticuerpos (Figura 1, paso 6). La molécula de ADN concatemérico se visualiza utilizando oligonucleótidos etiquetados fluorescentemente que hibridan en múltiples secuencias únicas dispersas a través del ADN amplificado (Figura1,paso 7)2. La señal PLA generada, que aparececomo un punto fluorescente (Figura 1, paso 7), corresponde a la ubicación del complejo proteico objetivo en la célula. Como resultado, el ensayo podría detectar complejos proteicos con alta precisión espacial. La técnica no se limita a simplemente capturar interacciones proteicas, sino que también podría utilizarse para detectar moléculas individuales o modificaciones de proteínas en proteínas con alta sensibilidad1,2.
Hsp70 forma un sistema de chaperona altamente versátil fundamentalmente importante para mantener la homeostasis de proteínas celulares participando en una serie de funciones domésticas y asociadas al estrés. Las actividades de limpieza del sistema de chaperone Hsp70 incluyen plegado de proteína sin novo, translocación de proteínas a través de membranas celulares, montaje y desmontaje de complejos proteicos, regulación de la actividad proteica y vinculación de diferentes plegados proteicos/ máquinas de control de calidad3. El mismo sistema de chaperone también vuelve a doblar las proteínas mal dobladas/desplegadas, previene la agregación de proteínas, promueve la desagregación de proteínas y coopera con las proteasas celulares para degradar las proteínas terminales mal dobladas/dañadas para facilitar la reparación celular después de estrés proteotóxico4,5. Para lograr esta diversidad funcional, el acompañante Hsp70 se basa en cochaperones asociados de la familia JDP y factores de intercambio de nucleótidos (NEF) que ajustan el control alostérico dependiente del ATP del Hsp70 de la unión y liberacióndesustratos3, 6. Además, los cochaperones JDP desempeñan un papel vital en la selección de sustratos para este versátil sistema de chaperón. Los miembros de esta familia se subdividen en tres clases (A, B y C) basadas en su homología estructural al prototipo JDP, el E. coli DnaJ. Los JDP de clase A contienen un dominio J de N-terminal, que interactúa con Hsp70, una región rica en glicina-fenilalanina, una región de unión de sustrato que consta de una región similar a un dedo de zinc (ZFLR) y dos dominios de barril, y un dominio de dimerización de terminal C. Los JDP con un dominio J n-terminal y una región rica en glicina-fenilalanina, pero que carecen de ZFLR, entran en la clase B. En general, los miembros de estas dos clases están involucrados en funciones de chaperoning. Los miembros comprendidos en la clase catchall C, que contiene JDP que solo comparten el dominio J4, reclutan Hsp70s para realizar una variedad de funciones no acompañantes. El importante papel de los JDP como "adaptadores" intercambiables de reconocimiento de sustratos del sistema Hsp70 se refleja en una expansión de los miembros de la familia durante la evolución. Por ejemplo, los seres humanos tienen más de 42 miembros distintos de JDP4. Estos JDP funcionan como monómeros, homodímeros y/o homo/hetero oligomeros4,5. Recientemente, una cooperación funcional a través de la formación compleja transitoria entre la clase A (por ejemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) y clase B (por ejemplo, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDPs eucariotas se informó para promover el reconocimiento eficiente de los agregados de proteína amorfo in vitro7,8. Estos complejos JDP de clase mixta se ensamblan presumiblemente en la superficie de las proteínas agregadas para facilitar la formación de desgas de proteínas a base de Hsp70- y Hsp70+Hsp1007,8,9, 10. La evidencia crítica para apoyar la existencia de estos complejos JDP de clasemixta formados transitoriamente en células eucariotas fue proporcionada con PLA 8.
PLA se emplea cada vez más para evaluar las interacciones proteicas en metazoa, principalmente en células de mamíferos. Aquí, informamos de la expansión exitosa de esta técnica para monitorear complejos de chaperone formados transitoriamente en organismos unicelulares eucariotas y procariotas como la levadura en ciernes S. cerevisiae y la bacteria E. coli. Es importante destacar que esta expansión pone de relieve el uso potencial del PLA en la detección y análisis de microbios que infectan células humanas y animales.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Merck</td><td>103999</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-DNAJA2</td><td>Abcam</td><td>ab157216</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNAJB1 Anticuerpo Enzo</td><td>Life Sciences</td><td>ADI-SPA-450</td><td></td></tr><tr><td>anti-DnaK</td><td>Anticuerpo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>interno anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Sis1</td><td>Cosmo Bio Corp</td><td>COP-080051</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Ydj1</td><td>StressMarq Biosciences</td><td>&nbsp; SMC-150,</td><td></td></tr> <tr><td>anticuerpo anti-YFP</td><td>En casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tarro de tinción de portaobjetos Coplin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5516</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de diagnóstico</td><td>Marienfeld</td><td>1216530</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fischer</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Reactivos de detección in situ Orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92007</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink In Medio de montaje in situ + DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de PLA in situ DuoLink Anti-Mouse MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de PLA in situ DuoLink Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink Tampones de lavado in situ, fluorescencia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal</td><td>Thermo-Fischer</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P47-07</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Merck</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo-Fischer</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zimolasa 100T // Lyticase</td><td>Estados Unidos Biológico</td><td>Z1004</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Las proteínas de dominio J (JD) forman la familia de co-chaperona más grande y diversa en las células eucariotas. Los hallazgos recientes muestran que miembros específicos de la familia JDP podrían formar heterocomplejos transitorios en eucariotas para ajustar la selección de sustratos para los disaggregases de proteína a base de chaperone de 70 kDa (Hsp70). Los complejos JDP apuntan a proteínas agregadas inducidas por estrés agudo/crónico y presumiblemente ayudan a ensamblar los desaggregases mediante la contratación de múltiples Hsp70 a la superficie de los agregados proteicos. El alcance de la red de control de calidad de proteínas (PQC) formada por estos JDP que interactúan físicamente sigue sin caracterizarse in vivo. Aquí, describimos un ensayo de interacción de proteína in situ basado en microscopía denominado ensayo de ligadura de proximidad (PLA), que es capaz de capturar de forma robusta estos complejos de chaperona formados transitoriamente en distintos compartimentos celulares de células eucariotas. Nuestro trabajo amplía el empleo de PLA de células humanas a levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Escherichiacoli), lo que convierte en una herramienta importante para monitorear la dinámica de los conjuntos de proteínas formadas transitoriamente en ambos células procariotas y eucariotas.

Nuestros estudios in vitro anteriores con proteínas purificadas revelaron que un subconjunto de JDP de clase A y Clase B forman complejos JDP de clase mixta transitoria para apuntar eficientemente a una amplia gama de proteínas agregadas y posiblemente facilitar el montaje de Hsp70-basado en desgastegas proteicas7. Empleamos PLA para determinar si los complejos JDP de clase mixta (A+B) ocurren en células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa). Los JDP humanos DNAJA2 (clase A) y DNAJB1 (clase B)...

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Este método captura interacciones proteicas transitorias en organismos como bacterias y levaduras y en diferentes tipos celulares. Aquí monitoreamos complejos de chaperona específicos formados transitoriamente que están involucrados en la proteostasis celular. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar información sobre la dinámica y localización subcelular de conjuntos procariotas y eucariotas.Adaptaciones de esta técnica en organismos unicelulares como bacterias y levaduras, permite a los investigadores utilizarla como una poderosa herramienta para investigar enfermedades relacionadas con infecciones microbianas. Esta técnica podría emplearse potencialmente para analizar las interacciones proteicas en casi todos los organismos simplemente cambiando las condiciones en la fase de preparación de la muestra del protocolo. Es importante seleccionar anticuerpos de buena calidad que sean específicos y probados en inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ELISA o inmunoprecipitaciones.Comience por pretratar diapositivas de diagnóstico de 10 pocóditos con poli-L-lisina. Añadir 100 microlitros de estéril y filtrado 0.0001%poli-L-lisina a cada pocóptero, e incubar los po

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.

Ensayo Replegado intracelular

Fuente: Dahl, J. et al. Detección de la actividad dependiente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra un ensayo basado en un espectrofotómetro de fluorescencia para evaluar la actividad de chaperonas en una proteína sustrato sometida a estrés ácido y térmico. Describe los pasos para monitorizar el despliegue y la agregación del sustrato mediante dispersión de luz, comparando las condiciones con y sin el acompañante.

Evaluación de la actividad bacteriana de chaperona mediante el despliegue térmico de una proteína modelo

La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado,...

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

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Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Describimos un método para experimentos de agotamiento-rescate que preserva la integridad celular y la homeostasis de las proteínas. La adenofección permite análisis funcionales de proteínas dentro de procesos biológicos que se basan en dinámicas basadas en actina finamente ajustadas, como la división celular mitótica y la miogénesis, a nivel de una sola célula.

Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

La reticulación cinética y el análisis del ADNc es un método que permite la investigación de la dinámica de las interacciones proteína-ARN en células vivas a alta resolución temporal. Aquí se describe el protocolo en detalle, incluido el crecimiento de células de levadura, la reticulación UV, la recolección, la purificación de proteínas y los pasos de preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación.

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Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

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Este protocolo presenta una técnica para sondear las interacciones proteína-proteína utilizando perlas de donantes ligadas al glutatión con co-chaperonas con motivos TPR fusionadas con GST y perlas aceptoras junto con un péptido derivado de Hsp90. Hemos utilizado esta técnica para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Aprende a monitorear ensamblajes transitorios de chaperonas J-domain y Hsp70 en bacterias, levaduras y células humanas mediante ensayo de ligación de proximidad in situ. Esta técnica revela dinámicas de proteostasis celular.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

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