Genetics
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मानव मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से प्राप्त सीधे रीप्रोग्राम्ड मायोट्यूब में एक्सोन लंघन
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Summary May 7th, 2020
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इस लेख में, हम एक्सॉन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी मांसपेशियों के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Transcript
हमने मानव मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मायोट्यूब में सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए एक नया प्रोटोकॉल स्थापित किया है। यह इन विट्रो मॉडलिंग हमें ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के साथ रोगी से प्राप्त मायोट्यूब में एक्सोन लंघन का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है। हमें पता चला कि 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड, DZnep, हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेज अवरोधक काफी समय की एक छोटी राशि में myotube में UDCs की सीधी स्क्रीनिंग को बढ़ावा दे सकता है ।
इस नए ऑटोलॉगस यूडीसी आधारित रोग मॉडलिंग विभिन्न मांसपेशियों की बीमारियों के लिए आवेदन सटीक दवा के लिए नेतृत्व कर सकता है। शुरू करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर पूरे मूत्र नमूना अपकेंद्रित्र। इसके बाद, ट्यूब में एक मिलीलीटर छोड़ने वाले सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
मूत्र के शेष एक मिलीलीटर में अलग-अलग छर्रों को फिर से खर्च करें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में उन ले लीजिए और ट्यूब के लिए 10 मिलीलीटर वाशिंग बफर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
ट्यूब में 0.2 मिलीलीटर छोड़ने वाले सुपरनेट को एस्पिरेट करें। प्राथमिक माध्यम के 4.5 मिलीलीटर में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। जिलेटिन के तीन कुओं में कोशिकाओं को बीज-लेपित छह अच्छी तरह से थाली, १.५ मिलीलीटर सेल निलंबन प्रति अच्छी तरह से ।
37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर संस्कृति। तीन दिनों के लिए प्रत्येक दिन प्राथमिक माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। चार दिन, पांडुलिपि में वर्णित के रूप में विकास माध्यम पूरक के १.५ मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह ।
चार दिन के बाद, पूरक विकास माध्यम हर दूसरे दिन की जगह जब तक UDC संस्कृति ८० से ९०% ढुलमुल है । फिर माध्यम निकालें और कोशिकाओं को पीबीएस से धो लें। 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके कोशिकाओं को विभाजित करें।
एक नए जिलेटिन-लेपित 60 मिलीमीटर पकवान पर प्रति चुकता सेंटीमीटर 3, 000 से 5, 000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज। एक जिलेटिन लेपित 60 मिलीमीटर पकवान पर प्रति वर्ग सेंटीमीटर 3, 000 से 5, 000 कोशिकाओं पर यूडीसी बीज और इनक्यूबेटर में पकवान जगह है। सीडिंग के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को 200 के संक्रमण की बहुलता पर गल रेट्रोवायरस से संक्रमित करें।
8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड एकाग्रता के साथ ताजा माध्यम का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट। MYOD1-transduced कोशिकाओं का चयन करने के लिए, ताजा विकास माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह प्यूरोमाइसिन के एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त ।
सात से 10 दिन तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलते रहें। एक कोलेजन लेपित बहु-अच्छी प्लेट में MYOD1-transduced UDCs प्लेट। कोशिकाओं को 24 घंटे तक इनक्यूबेटिंग करने के बाद, विकास माध्यम को पांडुलिपि में वर्णित विभेदन माध्यम में बदलें।
फिर तीन दिनों के बाद, DZNep के बिना नए भेदभाव माध्यम में भेदभाव माध्यम बदलें। हर तीन दिन में माध्यम बदलते रहें। मायओडी1-ट्रांसड्यूडेड यूडीसी में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को स्थानांतरित करने के लिए, एसो ट्रांसफैक्शन रीएजेंट और विभेदन माध्यम को एक से 10 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में मिलाएं।
और इस मिश्रण का उपयोग कुओं में माध्यम को बदलने के लिए करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें। एएसओ के साथ इनक्यूबेशन 72 घंटे के बाद, एएसओ के बिना माध्यम को नए सिरे से भेदभाव माध्यम में बदलें।
ASO ट्रांसफैक्शन के तीन से सात दिन बाद, विभेदन माध्यम को हटा दें। पीबीएस के साथ एक बार यूडीसी धोएं और सेल लाइसिस बफर जोड़ें। आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल आरएनए को काटा।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें। जैसा कि पांडुलिपि में वर्णित है, पीसीआर ट्यूबों में वन-स्टेप आरटी-पीसीआर के लिए रिएजेंट्स को मिलाएं। पीसीआर ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें और थर्मोसाइकिल चलाएं।
माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस करें और एक्सोन लंघन दक्षता की गणना करें। यूडीसी को प्राथमिक संस्कृति के एक सप्ताह के भीतर आसानी से और गैर-निवास और गठन कॉलोनियों को आसानी से एकत्र किया गया था। DZNep के साथ विभेदन माध्यम में MYOD1 संक्रमित यूडीसी एक दूसरे को फ्यूज कर सकता है और कुशलता से बहुनीय मायोट्यूब का गठन कर सकता है।
आरटी-पीसीआर ने ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी वाले रोगियों से प्राप्त MYOD1-UDCs में एक्सोन लंघन का स्पष्ट रूप से पता लगाया । लंघन दक्षता ASO की खुराक पर निर्भर था। खुराक पर निर्भर exon लंघन भी पश्चिमी दाग द्वारा पता चला था ।
डिस्ट्रोफिन की तीव्रता को एएसओ ट्रांसफैक्शन के एक सप्ताह बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ मापा गया था। नियंत्रण की तुलना में एएसओ के साथ इलाज किए गए MYOD1-UDCs में स्पष्ट रूप से उच्च फ्लोरोसेंट सिग्नल देखे गए। हम किसी भी मांसपेशियों की बीमारी मॉडल उन रोगों के रोगविज्ञान की समझ के लिए अग्रणी कर सकते हैं ।
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