Biochemistry
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Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos
Chapters
Summary May 16th, 2021
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El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.
Transcript
Este protocolo es útil para campañas de descubrimiento de leads de base fragmentada como una herramienta adicional para seleccionar fragmentos prometedores como candidatos de calor. Nano DSO para el cribado de fragmentos utiliza una cantidad limitada de muestra de proteína sin etiquetar y se puede utilizar de forma rutinaria para casi todos los objetivos de proteínas. Este método se puede utilizar para examinar cualquier colección de ligandos.
o para verificar los calores de los otros métodos. Saque una placa de fragmento del congelador de menos 20 o menos 80 grados centígrados y déjela descongelar a temperatura ambiente con un suave agitador en un agitador de sobremesa. Centrifugar la placa a 500 veces G durante 30 segundos para recoger las gotas que se adhieren al costado de los pozos.
Tome una placa de cristalización MRC de 2 pozos y pipetee 15 microlitros de la solución de almacenamiento de proteínas en cada subburmento utilizando una pipeta multicanal. Para verificar las definiciones de fragmentos y placas de proteínas en el Mosquito, encienda el dispensador nano y asegúrese de que no haya obstáculos alrededor de los componentes en movimiento. Abra la interfaz gráfica de usuario, haga clic en la pestaña Configuración y en Configuración de cubierta compruebe si el tipo de placa en la que se suministran los compuestos y aquella en la que se transfiere la proteína ya están presentes en la lista de placas disponibles.
De lo contrario, haga clic en Opciones y, a continuación, en Placas y cree una nueva definición de placa rellenando los valores correctos para el tipo de propiedad. En la pestaña Configuración, especifique las posiciones de la placa en Configuración de la plataforma. Usando el menú desplegable, elija la placa inferior Grainier U para la posición uno y la placa MRC de 2 pozos para la posición dos y guarde el protocolo.
Coloque la placa de fragmentos en la posición uno y la placa de proteínas en la posición dos de la cubierta. En la pestaña de protocolo, haga clic en Archivo y elija el protocolo guardado en el paso anterior para dispensar los fragmentos. Definir el volumen de los fragmentos a dispensar como 0,3 microlitros.
Para una placa típica donde las columnas uno y 12 no contienen fragmentos, defina la ubicación Inicio en la columna dos y la ubicación Fin en la columna 11. En algunas placas, si las columnas dos u 11 están vacías, use las columnas tres y 10 como valores iniciales y finales. Haga clic en Ejecutar para iniciar el programa.
Después de la dispensación, que tarda unos dos minutos en completarse, retire la proteína y las placas de fragmentos del robot y séllelas con una película de sellado adhesiva. Centrifuga brevemente la placa de proteína a 500 veces G durante 30 segundos para recoger cualquier gota que se adhiera a los lados de los pozos antes de proceder al siguiente paso. Inspeccione visualmente los pozos de la placa de proteínas en busca de precipitaciones que podrían haber ocurrido debido a la adición de los fragmentos.
Si se observa precipitación en muchos pozos, reduzca la concentración de los fragmentos y repita el experimento. Encienda el instrumento Prometheus. En la pantalla táctil, pulse Abrir cajón para acceder al módulo de carga capilar del instrumento.
Retire la banda magnética del módulo de carga y limpie el espejo con etanol para eliminar las partículas de polvo. Para transferir una solución de la placa de fragmentos de proteína a los capilares, coloque la placa de proteína y los capilares junto al instrumento para facilitar el acceso al módulo de carga capilar. Tome un capilar sosteniéndolo en un extremo y toque la solución en la placa de proteína con el otro extremo del capilar para transferir la muestra.
Siempre use guantes y asegúrese de no tocar el capilar en el medio, ya que las impurezas de los guantes afectarían la medición. Coloque el capilar en la posición designada del soporte, asegurándose de que esté correctamente alineado y centrado, repita estos pasos para llenar todas las posiciones en el módulo de carga. Al final, coloque la banda magnética en la parte superior de los capilares para mantenerlos en su lugar y presione Cerrar cajón para iniciar el experimento Nano-DSF.
Abra la aplicación Prometheus PR. ThermControl y cree un nuevo proyecto haciendo clic en Iniciar nueva sesión. Primero, haga un escaneo de descubrimiento para detectar la fluorescencia de las muestras. Altere la señal fluorescente de las muestras ajustando la potencia de excitación del láser.
Para una desnaturalización térmica, haga clic en la pestaña Melting Scan, establezca la temperatura de inicio en 20 grados centígrados, la temperatura final en 95 grados centígrados y la pendiente de temperatura en un grado centígrado por minuto. Luego haga clic en Iniciar medición. Aquí se muestra la distribución de frecuencia de la temperatura de desplazamiento y fusión para la proteína externa, cinética o altamente expresada en cáncer, el dominio de repetición tetratricopéptido regulador de la quinasa monopolar del huso 1 y la proteasa similar al SARS-CoV-2 3c.
Los valores negativos indican una reducción en la temperatura de fusión en presencia de un fragmento, mientras que un valor positivo indica un aumento en la temperatura de fusión. Para Nsp5, todos los fragmentos tienen un efecto desestabilizador, mientras que para Hec1 y Mps1, se observan golpes estabilizadores y desestabilizadores. Este es un método barato y rápido para filtrar bibliotecas de fragmentos.
Otros métodos como la RMN o la cristalografía de rayos X pueden mostrar la unión exacta de los fragmentos y también están disponibles a través del descubrimiento de INX. Los resultados con la proteasa del coronavirus ayudaron a proponer nuevos compuestos que se pueden desarrollar en medicamentos contra el COVID-19.
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