Name: 使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: 学习使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集方法，通过倾斜样品台增加颗粒取向分布，减少取向偏好偏差，提高电镜密度图质量和可解释性，适用于结构生物学研究。

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我们感谢 Bill Anderson、Charles Bowman 和 Jean-Christophe Ducom（TSRI）在显微镜技术、Leginon 安装及数据传输基础设施方面提供的帮助。我们还感谢 Gordon Louie（Salk 研究所）和 Yong Zi Tan（新加坡国立大学）对稿件的审阅。我们感谢 Chris Russo（英国剑桥 MRC 分子生物学实验室）为我们提供了表达 DPS 的质粒。&#160;本研究得到了美国国立卫生研究院（U54AI150472、&#160;U54 AI170855 和 R01AI136680，授予 DL）、美国国家科学基金会（NSF MCB-2048095，授予 DL）、Hearst 基金会（授予 DL）以及 Arthur 和 Julie Woodrow 讲席基金（授予 J. P. N.）的资助。T.S. 获得了美国国立卫生研究院 F32 博士后奖学金（GM148049）的支持。

1. 样品制备
<ol>
	<li>使用含有金箔和金网格支撑的载网16（参见材料表），因为倾斜数据采集会加剧电子束诱导的运动17。 
	注意：在本研究中，载网上的样品在湿度高于80%的低温环境（约4 °C）中，通过手动浸入和 blotting 技术进行玻璃化冷冻18。</li>
	<li>应避免使用含铜支撑和碳箔或非晶碳连续层的载网，除非绝对必要，因为在样品台倾斜时，这些载网可能导致更大的电子束诱导运动16。 
	注意：与非晶碳相比，石墨烯/氧化石墨烯等替代支撑层似乎可减少电子束诱导的位移19,20。</li>
	<li>预先筛选载网，并识别具有合适冰层厚度和颗粒分布的区域。颗粒过于密集的载网在倾斜数据采集过程中会导致颗粒重叠，可能影响后续的数据处理步骤。 
	注意：这些步骤具有主观性，因为判断优质冰区是通过视觉检查离焦图像中颗粒对比度清晰的区域来完成的。对于某些样品，这可能不可行，因为部分样品在薄冰区域无法有效分布，从而在数据采集过程中带来挑战（详见讨论部分）。</li>
	<li>对含有目标蛋白样品的载网进行玻璃化冷冻。此处为演示目的，我们使用饥饿期间DNA保护蛋白（DPS蛋白）（参见材料表），浓度范围为0.1–0.5 mg/mL，并采用金箔和金支撑载网。 
	&#8203;注意：蛋白纯化方法如前所述，但未进行TEV蛋白酶切割21。不同样品所需的蛋白浓度范围需单独优化，因为很难确定一个普遍适用的理想浓度范围，且不同样品之间几乎必然存在差异。</li>
</ol>
2. 设置倾斜数据采集
<ol>
	<li>调整显微镜以确保对样品进行平行照明，并尽量减少彗差22。 
	注意：在无样品台倾斜的标准单颗粒分析（SPA）数据收集中，显微镜必须良好对齐。对于倾斜数据采集，无需特殊对齐，但良好的对齐可确保定位和成像顺利进行。倾斜与非倾斜数据采集的通用方案比较见图2。</li>
	<li>在无样品台倾斜的情况下记录载网图谱，以识别适合数据采集的方格，或在方格采集节点使用的放大倍数下手动检查方格。寻找支持膜完整、无脱水迹象且冰层厚度理想的方格。 
	注意：方格采集节点是Leginon中用于多尺度成像的低倍率节点。
	<ol>
		<li>对于典型的非倾斜自动化数据采集，记录一张载网图谱，以概览整个载网的质量，并初步判断适合数据采集的区域。</li>
		<li>随后通过图谱选择合适的方格并将其提交至队列。然后通过手动选择孔洞或使用自动电子显微镜（EM）孔洞识别工具，将孔洞目标排队并提交。</li>
		<li>最后，使用自动EM孔洞识别工具提交高倍率曝光目标。 
		注意：对于倾斜数据采集，为获得一致结果，可能需要手动排队方格，特别是当最优倾斜角度尚未预先确定且可能在数据采集过程中进行调整时。如果数据采集所用的倾斜角度已预先确定，也可使用预设的样品台倾斜角度来记录载网图谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品台移动至感兴趣的方格位置。</li>
	<li>使用±15°样品台倾斜下的α摆动法（α-wobbler）确定当前样品台位置的齐焦高度。通过显微镜的键盘面板调节Z轴高度，使样品台达到齐焦高度。确保在α摆动过程中图像位移最小。 
	注意：如果未正确识别齐焦高度，在方格放大倍数下倾斜样品台时将观察到较大的图像位移。如果载网上存在局部形变（例如载网断裂或在成像区域附近严重弯曲），也可能出现此现象。尽管应尽量避免在这些区域进行数据采集，但如果这些区域是少数有希望的采集区域之一，则必须准确估算其齐焦高度。图3展示了在未正确识别齐焦高度的情况下进行定位可能导致方格放大倍数下出现大幅图像位移。</li>
	<li>使用聚焦节点寻找更精确的Z轴高度，并点击模拟。
	<ol>
		<li>通常在方格采集节点所用的放大倍数下，在聚焦节点中估算Z轴高度。 
		注意：聚焦节点的聚焦序列也可在数据采集期间包含在孔洞采集节点（Leginon软件中的一个工具）放大倍数下的精细Z轴聚焦估算。</li>
		<li>根据初始方格排队情况，调整聚焦节点的设置，并启用或禁用精细Z轴聚焦选项。 
		注意：在自动化数据采集开始时，必须确保齐焦高度已准确识别，这可能需要重新启用精细Z轴聚焦（步骤2.10）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品台在真实齐焦高度下倾斜至数据采集所需的角度，并在必要时重新居中样品台。本研究中使用了0°、30°和60°的倾斜角度。在方格采集节点中点击模拟，以开始为孔洞采集节点的曝光排队目标。 
	注意：如步骤2.2.1所述，可使用预设的样品台倾斜角度记录载网图谱，从而避免在此步骤再次倾斜样品台。若数据采集所用的倾斜角度已预先设定，此方法效果良好且可加快流程。当前方案针对新样品编写，用户可能希望测试不同倾斜角度以进行数据采集。</li>
	<li>选择一个Z轴聚焦目标以及适合高倍率曝光的含孔区域。</li>
	<li>点击将目标提交至队列以进行成像。在完成所有方格的排队之前，请勿点击“提交已排队目标”。</li>
	<li>将样品台恢复至无倾斜状态。移动至下一个方格，并重复步骤2.3–2.8，直至已排队足够数量的孔洞曝光。</li>
	<li>进入孔洞定位节点，在所有方格均完成排队后点击提交已排队目标。 
	注意：如果此前为节省时间而禁用了精细Z轴聚焦（步骤2.5），则在提交队列前需重新启用该功能。</li>
	<li>手动检查高倍率曝光采集节点所选的目标，以测试当样品台倾斜时，自动EM孔洞识别工具是否能准确识别适合图像采集的区域。
	<ol>
		<li>在此过程中，在曝光采集节点设置中选择“允许用户验证所选目标”。当用户对定位准确性满意后，取消选择此选项以进行自动化数据采集。 
		&#8203;注意：高倍率曝光采集节点中的目标通常采用束倾斜图像位移策略进行成像，该策略在倾斜和非倾斜数据采集中均同样有效23,24,25,26。为了在后续数据处理步骤中实现准确的CTF估计，必须对束倾斜图像位移采集策略执行透镜彗差校准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>在数据采集过程中，启动实时数据处理10,27,28,29，包括对记录的电影进行运动校正、CTF 估计、颗粒挑选以及初始重构的生成。 
	注意：在本研究中，使用了 cryoSPARC Live10（见材料表）进行预处理。实时数据处理可提供初步的冷冻电镜重构图谱以及角度分布的近似情况，从而帮助用户评估分辨率各向异性的程度。这些信息可进一步指导用户判断数据采集所用的倾转角度是否足够高。</li>
	<li>可视化重构图谱并绘制欧拉角分布图，以评估颗粒优势取向的程度。 
	注意：欧拉角分布可直接转换为傅里叶空间采样分布，以确定分辨率各向异性的潜在程度。已开发出一种图形用户界面（GUI），用于协助用户评估欧拉角分布的质量并确定最佳倾转角度30,31。该工具可从 Github 仓库获取：https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui。</li>
	<li>如有必要，调整数据采集时的样品台倾转角度，以克服优势取向的影响。如果在步骤 3.2 中通过重构图谱和欧拉角分布发现优势取向问题仍然存在，则可增加倾转角度。或者，用户也可将数据采集分为若干组，采用多个不同的倾转角度进行记录，例如 20°、30° 和 40°。 
	注意：尽管大多数透射电子显微镜（TEM）具备将样品台倾斜至 70° 的能力，但我们常用的样品台倾转角度范围为 20°–40°。</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
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<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于样品附着在气液界面而导致的颗粒优势取向问题是目前利用冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）实现常规高分辨率结构解析的最后几个主要瓶颈之一4,5,6。本文介绍的数据采集方案提供了一种易于实施的策略，可改善数据集中颗粒取向的分布情况。需要指出的是，该方案无需额外的设备或软件，且不影响数据采集速度。在对倾斜样品进行数据采集时，需注意以下几点。
首先，成像方格必须处于等中心高度，以实现最佳定位。等中心高度通过在较小的样品台倾斜角度（通常为0.5°–2°）下记录倾斜对图像，并根据预先定义的图像漂移与离焦之间的关系来确定焦距进行调整。如果目标方格需要对等中心高度进行较大调整，则会导致方格图像发生显著的图像漂移，从而在样品台再次倾斜时，视野可能被物镜光阑遮挡。
其次，在中等放大倍数（孔洞采集节点放大倍数）下，原本...

过去十年中，直接电子探测器的出现1,2,3 极大地推动了利用单颗粒冷冻电镜技术解析大分子及大分子复合物高分辨率结构的数量呈指数级增长4,5,6。几乎所有经过纯化的大分子种类都适用于冷冻电镜结构解析，唯独分子量约10 kDa或更小的蛋白质除外7。相较于核磁共振波谱学和X射线晶体学等其他结构解析技术，冷冻电镜在样品制备和结构解析过程中所需的起始材料用量至少低一个数量级4,5,6。
然而，通过冷冻电镜（cryo-EM）进行结构解析的一个主要挑战在于成像所用载网的合适制备。一项广泛的研究评估了使用不同玻璃化策略和载网处理多种样品的情况，结果表明，大多数在冷冻电镜载网上实现样品玻璃化的方法都会导致大分子优先黏附于气液界面8。这种黏附可能引发四种次优结果：（1）大分子样品完全变性，导致无法成功进行数据采集和处理；（2）样品部分变性，此时可能仅能从大分子中未受损区域获得结构信息；（3）样品保持天然结构，但在图像中仅呈现相对于电子束方向的一组特定颗粒取向；（4）样品保持天然结构，图像中包含部分但并非全部可能的颗粒取向。对于情况（3）和（4），采用倾斜数据采集有助于最小化影响重构冷冻电镜图谱的方向性分辨率各向异性，并为多种样品提供一种普适性解决方案9。从技术上讲，倾斜同样可能有利于情况（2），因为变性可能发生在气液界面，从而同样限制了数据中所呈现的不同取向的数量。通过尝试不同的溶液添加剂，可能在一定程度上改变数据集中取向偏差的程度，但这些试错方法因普适性不足而受到限制。将样品台在单一优化倾斜角度下进行倾斜，即可通过改变成像实验的几何构型来改善取向分布9（图1）。由于优先取向的样品相对于电子束具有特定的几何构型，对于每一组优先取向，倾斜载网会在该组取向中心周围产生一个照明角度的锥形分布。因此，这种方法能够分散观测视角，从而改善傅里叶空间的采样以及方向性分辨率的各向同性。
在实际操作中，倾斜样品台存在一些不利因素。倾斜样品台会在整个视场中引入焦距梯度，这可能影响对比度传递函数（CTF）估计的准确性。倾斜数据采集还可能导致电子束诱导的颗粒运动增加，这是由于成像倾斜样品时电荷效应增强所致。网格倾斜还会导致表观冰层厚度增加，从而产生噪声更大的显微照片，并最终影响三维重构的分辨率5,9,10。这些问题可能通过应用先进的计算数据处理方法加以克服，相关方法在本方案及讨论部分中有简要描述。最后，倾斜还可能导致颗粒重叠增加，从而阻碍后续的图像处理流程。尽管通过优化网格上的颗粒浓度可在一定程度上缓解该问题，但仍需予以充分考虑。本文介绍了一种易于实施的倾斜数据采集方案，使用Leginon软件套件（一种自动图像采集软件），该软件开源免费，且兼容多种类型的电子显微镜11,12,13,14。该方法要求软件版本至少为3.0或更高，其中3.3及以上版本包含专门改进功能，以支持倾斜数据采集。本方案无需额外的软件或设备。有关计算基础设施和安装指南的详细说明可参见其他文献15。

<table><tbody><tr><td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td><td>Structura Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPS 蛋白</td><td></td><td></td><td>纯化方法改编自 K.Naydenova 等人在 IUCrJ. 2019 年 11 月 1 日；6(Pt 6): 1086&amp;ndash;1098 中描述的方案。</td></tr><tr><td>K2 Summit 直接电子探测器</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leginon 软件套件</td><td></td><td></td><td>C Suloway 等，《结构生物学杂志》，151 (1)：第 41–60 页。</td></tr><tr><td>手动冷冻装置</td><td></td><td></td><td>自制的类似断头台装置，用于电镜载网的玻璃化冷冻</td></tr><tr><td>Talos Arctica</td><td>FEI/Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 目载网</td><td>Quantifoil</td><td>N1-A14nAu30-01</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行的单颗粒分析（SPA）现已成为高分辨率结构生物学的主流技术。SPA结构解析依赖于获取包埋在薄冰层中的大分子颗粒的多个不同投影视图。理想情况下，若颗粒的投影取向呈均匀分布的随机取向，则可涵盖该分子所有可能的观察角度，从而获得具有各向同性方向分辨率的三维重构结果。然而在实际中，许多样品中的颗粒倾向于优先取向并吸附于气液界面，导致数据集中颗粒的取向分布不均，傅里叶空间采样不均匀，最终产生分辨率各向异性的三维密度图。通过倾斜样品台可有效改善取向分布的均匀性，从而提高傅里叶空间采样的各向同性，是克服分辨率各向异性问题的通用解决方案。本实验方案描述了一种基于Leginon软件的倾斜样品台自动化数据采集策略。该方法实施简便，无需额外设备或软件，适用于大多数用于生物大分子成像的标准透射电子显微镜（TEMs）。

使用浓度为 0.3 mg/mL 的 DPS 样品在 0°、30° 和 60° 倾斜角度下进行成像演示。不同倾斜角度的数据在同一载网上不同区域采集。高倾斜角度下的 CTF 分辨率拟合通常较差，本研究中比较的三组数据亦如此。图 4 展示了具有代表性的对比图像及二维分类平均结果。尽管不同倾斜角度下的蛋白质浓度保持不变，但较高的倾斜角度会使成像区域在颗粒浓度上显得更为密集。这可能对数据处理造成困难，因为颗粒重叠会增加三维重构和角度优化的复杂性。在对 0° 和 30° 倾斜数据集进行迭代二维分类时，通常可获得干净的颗粒堆栈；而 60° 数据集则需要仔细清理颗粒堆栈，以确保分类平均图中相邻颗粒的重叠程度最小。图 4C 中红框内的分类平均图即为颗粒重叠的一个示例。尽管在分类过程中重新居中可能导致邻近颗粒的信号被平均化，但严重的颗粒重叠会影响颗粒取向参数的准确性，导致重构结果分辨率降低。避免颗粒重叠的最佳策略是在前期筛选具有理想冰层厚度和颗粒分布的载网。有关评估倾斜数据采集改进效果的指标的全面定量综述，可参见其他文献<sup clas...

本方案描述了一种通用且易于实施的冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据采集方法。该方法对于因样品吸附于气液界面而导致优势取向偏差的样本，尤其有助于获得高质量的电镜三维结构图。

使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

冷冻电子显微镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）现已成为高分辨率结构生物学的主流技术。结构……

倾斜样品台为在单颗粒冷冻电镜数据收集中增加颗粒取向分布提供了一种简单且可推广的方法。由于样品台倾斜而获得的颗粒均匀分布有助于提高整体三维重构图的质量和可解释性。首先对显微镜进行校准，以确保对样品的平行照明，并尽量减少彗差像差。为了确定适合数据采集的方格，需记录一张网格图谱，可不使用载物台倾斜或使用载物台倾斜拍摄，以获得整体网格质量的概览，并初步判断适合数据采集的区域。在方格采集节点所用的放大倍数下手动检查各个方格，寻找其中支撑膜完整、无脱水迹象且冰层厚度理想的方格，并将样品台移动至感兴趣的方格位置。使用 alpha 摇摆功能，在约 15 度的样品台倾斜角度下确定样品台位置的等心高度，并通过显微镜的键盘面板调节 Z 轴高度，使样品台达到等心高度。确保在执行 alpha 摇摆程序期间图像漂移最小。为了获得更精确的 Z 轴高度，可在方格采集节点所用放大倍数下的调焦节点中估算该高度。调整调焦节点的设置，并在初始方格排队期间启用或禁用精细Z轴调焦选项。然后按“模拟”。将样品台倾斜至所需倾转角度，以在真实的等中心高度进行数据采集，并在必要时重新居中样品台。按下方形采集节点中的“模拟”按钮，开始为整个采集节点的曝光排队目标。接下来，选择一个Z轴对焦目标以及具有适合高倍曝光孔洞的区域，并将这些目标提交至成像队列。将样品台恢复至无倾转状态，然后移至下一个方格。重复这些步骤，直至已排队足够数量的完整曝光。当所有方格均已排队后，转至整体定位节点并点击“提交已排队目标”。在节点设置中选择“允许”以进行用户对选定目标的验证，并手动检查高倍曝光采集节点所选定的目标，以测试在样品台倾斜时，自动电子显微镜孔定位程序是否能准确识别出适合图像采集的区域。当用户对靶向准确性满意后，取消选中“允许用户验证所选目标”选项，以进行自动数据采集。此处展示了在接近和远离正焦面 Z 高度位置、以不同倾斜角度采集的网格代表性图像，图像为方形放大倍率。红色同心圆环的中心指示电子束的中心，绿色箭头指示感兴趣的方形区域。在目标方格附近有一个用于参考的破损网格特征。图中显示了在 0 度、30 度和 60 度倾转角度下采集的代表性孔洞曝光图像及二维分类平均图。尽管不同倾转角度下的蛋白质浓度保持不变，但较高的倾转角度会使成像区域在颗粒浓度上显得更加密集。受过度拥挤影响的2D分类平均图像显示在该红色框内。该方案的简便性使得显微镜的普通用户能够轻松采用倾斜数据采集策略。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学习使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集方法，通过倾斜样品台增加颗粒取向分布，减少取向偏好偏差，提高电镜密度图质量和可解释性，适用于结构生物学研究。

使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

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