Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

Biology

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Summary

Dans cet article nous présentons un protocole général pour la mesure de la durée de vie réplicative des cellules mères de la levure.

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Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209, doi:10.3791/1209 (2009).

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Abstract

Le vieillissement est un processus dégénératif caractérisé par une détérioration progressive des composants cellulaires et des organites résultant de la mortalité. La levure bourgeonnante

Protocol

Partie 1: Préparer des souches et des plaques pour l'analyse de durée de vie réplicative

Cette section décrit la préparation des plaques solides YEPD pour une utilisation dans l'expérience durée de vie réplicative et la préparation des cellules de levure pour l'analyse de la durée de vie.

  1. En utilisant une technique stérile échéant, de préparer des boîtes de gélose YEPD (extrait de levure 1%, 2% de bacto-peptone, 2% d'agar, 2% de glucose) qui sera utilisé pour les cellules de levure de culture et de l'analyse couvrent réplicative vie. Vous devez préparer au moins 2 plaques pour toutes les 4-5 souches à analyser dans l'expérience la durée de vie. Les plaques doivent être préparés au moins 2 jours avant l'expérience la durée de vie et laisser sécher avant de commencer le dosage durée de vie. Si l'expérience ne sera entrepris dans les 4-5 jours de verser les assiettes, ils devraient être placés dans un incubateur réfrigéré et enveloppé dans du parafilm ou de plastique pour empêcher la dessication.
  2. Enlever les souches de levure de stocks congelés et à balayage pour les colonies isolées sur gélose YEPD. Jusqu'à 6 souches peuvent être facilement rayé sur la même plaque YEPD en partitionnant la plaque dans de taille égale en forme de tarte coins.
  3. Incuber les cellules à 30 ° C pendant 2 jours.
  4. Retirer les cellules de l'incubateur et les cellules patch depuis une seule colonie sur une plaque fraîche YEPD. Deux patchs à partir de deux colonies différentes devraient être générés pour chaque souche. A cette époque, les souches à analyser doit être codé pour assurer l'expérimentation durée de vie réplicative est réalisée «en aveugle», où le dissecteurs ne sais pas l'identité des souches individuelles.
  5. Incuber les patché, les cellules codées à 30 ° C jusqu'au lendemain soir.
  6. Retirer les cellules et les cellules des plaques légèrement de chaque souche codé pour frais plaques YEPD, qui servira les plaques expérimentales utilisées pour l'analyse couvrent réplicative vie. Les cellules doivent être patché le long d'une ligne verticale sur le côté gauche de la plaque YEPD (figure 1). Environ 3-5 taches par plaque est optimale, en supposant que l'analyse durée de vie réplicative le 20 cellules de chaque patch. Il n'est pas nécessaire (ni souhaitable) de transférer un grand nombre de cellules de la plaque fraîche YEPD, car cela entraînerait des cellules à croître abondamment pendant la nuit d'incubation, qui peut limiter leur durée de vie réplicative ultérieures.
  7. Incuber les plaques fraîchement patché nuit sur la paillasse.

Partie 2: Position des cellules pour l'analyse de durée de vie réplicative.

Dans cette section, nous décrivons comment positionner les cellules de levure sur la plaque et la manière d'obtenir des cellules filles vierges pour l'analyse de durée de vie réplicative. De ce point, toutes les plaques doivent être parafilmed, sauf lorsque l'objet de dissection, afin d'éviter la dessiccation.

  1. En utilisant un microscope équipé d'un appareil de microdissection adapté à la levure, le transfert d'environ 50 cellules de la première souche patché à une position sur la plaque distale sur les cellules corrigées. Si votre platine de microscope est classé, ces gradations peuvent être utilisés pour assurer les cellules vont être facile à trouver pendant les itérations ultérieures. Sur le Axioscope Zeiss 40, les cellules de la première souche patché peut être placé aux coordonnées 90 x 10 et disposés verticalement à partir de là.
  2. Nettoyez l'aiguille des cellules par des reprises de toucher la surface d'agar, puis créer un trou dans la gélose en forçant l'aiguille à travers la surface de la gélose. Ce trou servira de repère pour vous orienter sur la plaque au cours des itérations suivantes de la dissection et l'enlèvement cellule fille. Soyez prudent de ne pas obtenir des cellules de levure dans le trou, ou ils vont grandir et de former une colonie.
  3. Directement au-dessus du trou, aligner verticalement des cellules de levure individuelles en 20 positions espacées uniformément, avec des diamètres d'aiguilles 1-3 (~ 100 pM) entre chaque position de la cellule (figure 1). Chaque petit nombre de cellules, placer deux cellules adjacentes les unes aux autres dans la même position dans la ligne plutôt qu'un seul. Cela permet de redondance lors de la sélection cellule fille vierge, si l'une des cellules transférées ne parvient pas à se diviser.
  4. Entre le 10 ème et 11 ème positions dans la ligne, créer une série horizontale de 7-8 trous dans la gélose. Cela servira comme un marqueur de vous orienter sur la plaque au cours des itérations suivantes de la dissection et l'enlèvement cellule fille. Soyez prudent de ne pas obtenir des cellules de levure dans les trous, ou ils vont grandir et de former une colonie.
  5. Répétez les étapes 2.1 à 2.4 pour chaque patch sur la plaque, en continuant à cellules gamme verticalement le long du même axe. Pour l'étape 2.2, le nombre de trous créés doivent correspondre au numéro de patch (un trou pour le premier patch, deux trous pour le second, etc.)
  6. Une fois que les cellules ont été déployées pour chaque patch, la plaque de parafilm et incuber à 30 ° C pendant environ 2 heures.
  7. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 pour chaque plaque à l'expérience.

Partie 3: Obtenir des cellules filles vierges pour l'analyse de la durée de vie

Dans cette section, nous initions à l'analyse la durée de vie en assurant que chaque cellule commence comme une fille viergecellulaire.

  1. Retirez les plaques de l'incubateur et vérifier que la plupart des cellules disposées ont subi une division cellulaire. Si un délai supplémentaire est nécessaire pour permettre la division cellulaire d'être terminée, retourner la plaque à l'incubateur.
  2. En commençant par la première cellule vêtu, utiliser l'aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère en plaçant délicatement l'aiguille sur le dessus des cellules ci-joint. Il est parfois utile d'exploiter le côté de la base de microscope pendant que l'aiguille est au repos sur les cellules.
  3. Placez la cellule fille détachée dans la ligne verticale, en remplacement de la cellule mère et de toute les cellules filles supplémentaires et en les déplaçant temporairement de côté.
  4. Répétez l'étape 3.2 et 3.3 pour chacune des cellules disposées. Si une cellule ne parvient pas à se diviser, de prendre une cellule fille de l'une des cellules redondantes positionné à l'étape 2.3. Lorsque vous avez terminé, vous devriez avoir 20 cellules filles pour chaque patch alignés verticalement sur la plaque de la durée de vie.
  5. Collecter toutes les cellules de la mère et cellules filles supplémentaires dans un tas et de les transférer à une zone proche de la correctifs («le cimetière»). Il est important de garder les cellules indésirables loin de l'analyse des cellules subissant une durée de vie pour prévenir la formation de microcolonies et l'épuisement des nutriments locaux.
  6. Parafilm la plaque et incuber à 30 ° C pendant environ 2 heures.
  7. Répétez les étapes 03.02 à 03.06 pour chaque plaque à l'expérience.

Partie 4: Mesure de la capacité réplicative des cellules individuelles

  1. Préparer la vie des données couvrent les feuilles. Une durée de vie des données feuille peut être une simple grille où chaque ligne correspond à une cellule mère individu et de chaque colonne correspond à un âge-point (figure 2). Étiquetez chaque fiche en fonction du nombre de souches à analyser.
  2. Retirez les plaques de l'incubateur et vérifier que la plupart des cellules disposées ont subi au moins une division cellulaire. Si un délai supplémentaire est nécessaire pour permettre la division cellulaire d'être terminée, retourner la plaque à l'incubateur.
  3. En commençant par la première cellule disposés sur la première plaque, observer visuellement la cellule mère et la fille (s) et déterminer le nombre de divisions cellulaires qui se sont produites. Il est généralement facile de déterminer combien de cellules filles d'une mère a produit, basée sur des motifs caractéristiques des arrangements de cellules. Notez le nombre de cellules filles produit par la cellule mère dans la case appropriée sur la feuille de pointage la durée de vie.
  4. Utiliser l'aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère comme décrit dans l'étape 3.2.
  5. Conserver la cellule mère dans sa position dans la ligne verticale et déplacez la cellule fille (s) temporairement de côté.
  6. Répétez les étapes 4.3 à 4.5 pour chacune des cellules disposées.
  7. Collecter toutes les cellules filles au rebut et les déplacer vers le «cimetière», situé près de l'origine des correctifs.
  8. Parafilm la plaque et incuber à 30 ° C pendant 2-3 heures.
  9. Répétez les étapes 04.03 à 04.08 pour chaque plaque à l'expérience.
  10. Répétez les étapes jusqu'à ce que toutes les cellules 04/02 au 04/09 mère ont arrêté de se diviser. En tant que mère cellules de l'âge, la progression du cycle cellulaire devient plus lent et il sera souhaitable d'incuber la plaque pendant de longues périodes de temps entre l'âge de points. Les plaques peuvent être placés à 4 ° C pendant la nuit.

Partie 5: des résultats représentatifs.

Les données brutes produites par une expérience de durée de vie est un réplicative des numéros de liste correspondant à des cellules filles produites par chaque cellule mère à chaque âge points (figure 2). En additionnant chaque ligne de la feuille de pointage, la durée de vie réplicative pour chaque cellule mère est obtenue. Les données pour les cellules de la mère d'un même groupe expérimental peuvent être regroupées pour générer une courbe de survie (figure 3A) et d'effectuer des calculs statistiques, tels que la durée de vie moyenne, la durée de vie médiane et écart-type. Un test non paramétrique, tels que le Wilcoxon test, peut être effectuée pour déterminer si des différences significatives dans la durée de vie n'a été décelée entre les groupes expérimentaux. Lorsque l'expérience fonctionne correctement, la courbe de survie devrait être à peu près conforme à Gompertz-Makeham cinétiques montrant une shap sigmoïde à une mortalité précoce à faible suite à une baisse relativement rapide du taux de survie et un aplatissement de la courbe des âges une plus tard. La plupart des souches de type sauvage ont des valeurs réplicative la durée de vie dans la gamme 20-30 génération, mais en dehors de la variation de cette gamme a été signalé.

Figure 1
Figure 1.5
Figure 1. Schéma d'une plaque de durée de vie typique réplicative. La soirée avant le début de microdissection de cellules de levure, 3-5 souches sont légèrement patché sur la surface d'une plaque YEPD (cases rouges) dans une ligne verticale sur un côté de la plaque. Après une croissance durant la nuit, environ 30 cellules individuelles de chaque souche sont disposées verticalement dans une ligne contenant 20 postes. Durée de vie analysis sera effectuée sur les cellules v vierge, fille obtenus à partir de ces cellules initiales. Cellules supplémentaires obtenus à partir de microdissection cours de l'expérience (par exemple, les cellules filles non désirées) sont placés dans «le cimetière» (ovale gris), qui est situé loin de la cellules expérimentales afin d'éviter l'épuisement local de nutriments que les colonies sont formées.

Figure 2
Figure 2. Une vie réplicative décompte durée de feuille. Les données brutes d'une expérience de durée de vie réplicative est montré. Chaque ligne correspond à une cellule mère de levure unique et chaque colonne correspond à un âge-point. Le numéro inscrit dans chaque case est le nombre de cellules filles produites par cette cellule mère à cet âge-point. Chaque souche est étiqueté avec un numéro codé de telle sorte que l'individu disséquer les cellules de levure n'a pas connaissance de l'identité des souches analysées. Vingt cellules sont dosés pour chaque souche.

Figure 3
Figure 3. Représentant de survie et de courbes de croissance d'une expérience de durée de vie réplicative. (A) Les courbes de survie sont obtenus en traçant la fraction de cellules mères encore en vie en fonction de l'âge réplicative (nombre de divisions cellulaires. (B) Les courbes de croissance sont obtenus en traçant la nombre moyen de cellules filles produites par une souche donnée en fonction de l'âge points. Dans cet exemple, la souche n ° 2 est plus longue durée mais est plus lente croissance, comme en témoigne la pente réduite initiale de l'intrigue de la croissance.

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Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention pour MK et BKK de la Fondation Médicale Ellison. MK est une Ellison Medical Foundation New Scholar liés au vieillissement. Nous tenons à remercier pour l'aide Soumya Kotireddy pendant le tournage.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agar Reagent Fisher Scientific DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone Reagent Fisher Scientific DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract Reagent Fisher Scientific DF0886-17-0 (288620)
Glucose

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References

  1. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genet. 3, (2007).
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