שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג'ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

Biology
 

Summary

הליך זה מתאר את זרימת עבודה קלה ומהירה להציג siRNA לתוך קשה transfect שורות תאים ופעל ביטוי גנים על ידי ה-PCR בזמן אמת. שימוש נגד תא אוטומטי, רב גם צלחת electroporation, ותחנת אלקטרופורזה אוטומטיות לספק תוצאות מהיר ואמין ללא צורך בטיפול רובוטית יקר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCoy, A. M., Litterst, C., Collins, M. L., Ugozzoli, L. A. Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells. J. Vis. Exp. (38), e1904, doi:10.3791/1904 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

השימוש מציאה בתיווך siRNA הגן ממשיך להיות כלי חשוב במחקרים של ביטוי גנים. מחקרים siRNA נערכות לא רק כדי לחקור את ההשפעות של downregulating גנים בודדים, אלא גם כדי לחקור מסלולי איתות ושאר רשתות אינטראקציה מורכבת. ניתוחים אלה דורשים מסלול הן את השימוש במודלים הסלולר רלוונטי ושיטות שגורמים ההפרעות פחות הפיזיולוגיה התאית. Electroporation הוא יותר ויותר בשימוש כדרך יעילה להציג siRNA וחומצות גרעין אחרים לתוך קשה transfect שורות תאים תאים ראשוניים מבלי לשנות את מסלול איתות תחת חקירה. ישנם שלבים קריטיים מרובים ניסוי מוצלח siRNA, ויש דרכים לפשט את העבודה תוך שיפור איכות הנתונים בשלבים ניסיוניים מספר. כדי לעזור לך להתחיל עם הפרויקט שלך siRNA בתיווך גן מציאה, נדגים כיצד לבצע מחקר מסלול שלם של איסוף ספירת התאים לפני electroporation דרך transfection הודעה בזמן אמת, ניתוח גנטי PCR הביטוי. המחקר הבא חוקר את תפקידם של activator תעתיק STAT6 בביטוי IL-4 גנים תלויים של CCL17 של קו תא לימפומה Burkitt (Namalwa). טכניקות הפגינו שימושיים עבור מגוון רחב של siRNA מבוססי ניסויים חסיד והן תאים ההשעיה. אנו גם להראות כיצד לייעל את התא לספור עם דלפק תא TC10 האוטומטית, כיצד electroporate דגימות בו זמנית באמצעות מערכת electroporation MXcell, ואיך בו זמנית להעריך איכות וכמות RNA עם מערכת אוטומטית Experion אלקטרופורזה.

Protocol

1. הכנה ספירת התאים Namalwa

  1. הסרת תאים מן הבקבוק תרבות צנטריפוגות את התאים גלולה. הסרת תאים supernatant ו resuspend בנפח ידוע של PBS. התאים השתמשו בפרוטוקול זה הם תאים ההשעיה. אם אתה משתמש תאים חסיד תצטרך trypsinize לפני איסוף.
  2. כדי לקבוע את מספר תאים חיים, כתם aliquot ההשעיה התא על ידי ערבוב זה 01:01 עם פתרון 0.4% כחול ו 10 trypan pipet μl של התערובת לשקופית של מנייה ולאחר מכן להכניס את השקופית לתוך התא TC10 האוטומטית לדלפק (Bio-Rad Laboratories, Inc).
  3. מונה TC10 תא פוקוס אוטומטי יהיה להבטיח את הספירה המדויקת ביותר, ולאחר מכן להמשיך לספור. הוא קובע באופן אוטומטי את הצפיפות של תאים חיים ותאים הכולל במדגם.
  4. בחר להציג תמונה להציג את התאים על מרקע. לאחר מכן בחר את המחשבון דילול יש הדלפק תא TC10 לחשב באופן אוטומטי את כמות התערובת התא יהיה צורך.
  5. ניסוי זה היא באמצעות מסך של שלושה siRNAs: אחד siRNA השליטה ושני siRNAs שונה מיקוד הגן STAT6, בתוספת שולטת untransfected. זה דורש 3.6 מ"ל בריכוז הסופי של 5 X 10 6 תאים לכל מיליליטר.
  6. הזן את הריכוז הרצוי וערכים נפח הסופי לתוך המחשבון הדילול, והיא מחשבת את נפח תא ההשעיה צורך על בסיס לספור את תא חי למדגם זה. לחילופין, לבצע את החישוב באופן ידני. ואז להעביר את נפח הנדרש תערובת תאים לניסויים אלה לתוך צינור חדש.
  7. ספין תערובות התא גלולה התאים ולהסיר את כל PBS. Resuspend ב 3.6 מ"ל של חיץ Pulser electroporation ג'ין (Bio-Rad Laboratories). העברת 800 aliquots μl לתוך צינורות המכילים את siRNAs המתאים ומערבבים בעדינות. התאים מוכנים כעת עבור electroporation.

2. Electroporating התאים 96-גם צלחות

  1. צלחת 96-electroporation גם מאפשר משכפל עבור כל ארבעת הטיפולים electroporated להיות ביחד.
  2. העברת 150 μl של השעיה התא לתוך בארות המתאים צלחת electroporation 96-היטב.
  3. הכנס את הצלחת הקאמרית צלחת electroporation MXcell ולסגור את המכסה.
  4. Electroporate באמצעות הגדרות מותאמות לקו התא חיץ בשימוש. תאים אלה הם electroporated באמצעות גל דעיכה מעריכית עם הגדרות המכשיר של 250 V, 350 μF, ו 1000 התנגדות Ω.
  5. לאחר electroporation תושלם, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות היטב כל לערבב ולאחר מכן להעביר תאים לצלחת רקמה תרבות המכילה מראש חימם התקשורת. תאים Namalwa מגדלים RPMI (Life Technologies) בתוספת 7.5% ו FCS pyruvate 1%.
  6. דגימות בקרה שלא היה electroporated לקוחים ההשעיה תא הנותרים נוספו מנות התרבות של המדיום מראש חימם תרבות זהה את התאים electroporated.
  7. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.
  8. לאחר 24 שעות, קבוצה אחת של תאים הושרה עם ריכוז 10 סופי ng / ml IL-4 רקומביננטי (R & D מערכות). הסט השני של תאים לשלוט רק לקבל מדיה נוספים. כל התאים מודגרת 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

3. חלץ ולבדוק RNA

  1. לאחר סך של 48 שעות של צמיחה, ספירת התאים היטב כל אחד, העברה חד aliquot מכל טוב צינור microfuge להפקת RNA, הקפאת aliquot השני ניתוח חלבון המערבי סופג או אחר.
  2. צנטריפוגה דגימות גלולה התאים, ולאחר מכן להסיר למחוק את supernatant מצינור אחד.
  3. המשך מיצוי RNA. אנחנו בדרך כלל להשתמש RNA סך אאורום Kit (Bio-Rad) על פי פרוטוקול כלל.
  4. כאשר ניטור מציאה בתיווך siRNA גן חשוב במיוחד כדי לאמת את איכות RNA RNA מושפל כי ייתן תוצאות מטעה. יחס 260/280 אינו מציין שלמות RNA ולכן חשוב להפעיל את דוגמאות על ג'ל או מכשיר microfluidic לאשר RNA אינם מושפל.
  5. כדי להעריך הן איכות וכמות בצעד אחד, דגימות אלה ינותחו באמצעות מערכת אוטומטית Experion אלקטרופורזה (Bio-Rad).
  6. ראשית, דגימות חום. לאחר מכן, הממשלה, עומס, והמערבולת שבב RNA Experion. הכנס את השבבים לתוך התחנה אלקטרופורזה Experion ולהתחיל לרוץ.
  7. לאחר ריצה תושלם, התוכנה תציג תוצאות Experion אוטומטית בצורת טבלה, electropherogram התוצאות (המציג ריכוז RNA, יחס ריבוזומלי, ומספר מדד איכות RNA), וכן ג'ל וירטואלית (אשר דומה ל-RNA המסורתית ג'ל). איכות גבוהה הכולל דגימות רנ"א יהיו בדרך כלל בעלי RQI של 8-10.

    4. בזמן אמת PCR

    1. לאחר בדיקת איכות RNA, להמשיך עם התגובות cDNA. בניסוי זה השתמשו צעד אחד iScript RT-PCR לערבב (Bio-Rad) לשלב סינתזה cDNA בזמן אמת PCR בתגובה אחת.
    2. הכן תערובת מאסטר המכיל את כל מרכיבי התגובה מלבד תבניות רנ"א עבור כל קבוצה פריימר, ולהפיץ אותם לתוך הצלחת PCR.
    3. לאחר דילול RNA ריכוז אחידה, מוסיפים את דגימות רנ"א של בארות המתאים. התגובה של כל מוגדר בשלושה עותקים.
    4. חותם את הצלחת, ולמקם אותו לתוך מערכת CFX384 PCR בזמן אמת (Bio-Rad). בחר את הפרוטוקול המתאים ולהתחיל לרוץ.
    5. לאחר ריצה תושלם, ביטוי גנים נקבע על ידי השוואת ביטוי הגנים של הגן של עניין מנורמל לגן התייחסות בתאים electroporated עם siRNA ניסיוני לנורמליזציה זהה של תאים electroporated עם שליטה siRNA.

    5. ניתוח מציאה siRNA

    1. הביטוי של CCL17 היה פיקוח באמצעות כמותי בזמן אמת PCR לחקור את תפקידם של activator תעתיק STAT6 ב אינדוקציה IL 4 תלויי של CCL17. לצורך ניסוי זה, GAPDH שימש הגן התייחסות. גנים התייחסות חלופית או גנים מרובים התייחסות ניתן להשתמש באותו אופן.
    2. תוכנת מנהל CFX מנורמל אוטומטית CCL17 ביטוי הביטוי של הגן התייחסות מן המדגם אותו בהשוואה אוטומטית את ערכי מנורמל כתוצאה לשלוט טיפולים פשוט על ידי בחירת GAPDH כמו "התייחסות" ואת הטיפול שליטה (siRNA לשלוט ללא אינדוקציה IL-4) כמו "שליטה" בחלון ההגדרות של התוכנה בניסוי מנהל CFX.
    3. ללא IL-4 אינדוקציה, שעתוק של CCL17 נשאר, רמות נמוכות מכוננת להשוות טיפול הביקורת.
    4. תאים המושרה עם IL-4 ושמירה על מסלול נורמלי STAT6 (כלומר, siRNA שליטה או טיפולים מלאה untransfected) הראה 80-10 אינדוקציה לקפל הביטוי CCL17.
    5. תאים המושרה עם IL-4 אבל עם ביטוי STAT6 מעוכבים על ידי הקדמה של siRNA STAT6 גם הראו ביטוי CCL17 רק על פי 2 גבוה יותר מאשר התאים uninduced המאשרת את תפקידו של STAT6 את הביטוי IL 4-Induced של CCL17.

    6. נציג תוצאות

    איור 1
    באיור 1. סקירה כללית של מסלול IL-4 איתות.
    א) הכבילה של IL-4 לקולטן שלו מוביל dimerization והפעלה של STAT6. הופעל STAT6 translocates לגרעין ומפעיל שעתוק של גנים היעד שלה, כמו CC17.
    ב) בלי אינדוקציה IL-4, שעתוק של CCL17 יישארו, רמות נמוכות מכוננת.
    ג) לאחר השתקת siRNA בתיווך של הגן STAT6, הטיפול עם IL4 צריך להוביל להגדיל מעט או ללא בביטוי CCL17.

    איור 2
    איור 2. אינדוקציה של CCL17 ידי IL4 נמדד על ידי תנאים שונים על ידי PCR כמותי זמן אמיתי.
    א) דוגמאות גדל ללא IL-4 הייתה רמה נמוכה של ביטוי מכוננת קשר של ביטוי גנים.
    ב) כפי שמוצג ירוק וכחול, דגימות בקרה הגיבו כלל לטיפול עם IL-4; עם גיוס של 8-10 לקפל CCL17. עם זאת, תאים transfected עם siRNAs מיקוד STAT6, באדום, ורוד, פחתה CCL17 ביטוי בתגובה IL-4, התומכים ברעיון STAT6 תפקיד הביטוי IL 4-Induced של CCL17.

Discussion

מאמר זה הוכיח כיצד electroporate siRNAs לתוך קשה transfect התא קו ההשעיה וכיצד לעקוב אחר התבטאות גנים בתאים אלה. כאשר עושים את זה הליך זה חשוב לזכור לשמור את הדברים כפי עקבי ככל האפשר בכל הדגימות.

Disclosures

הכותב הוא מועסק על ידי Bio-Rad Laboratories המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

Comments

1 Comment

  1. What is siRNA control for?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 21, 2010 - 1:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics