Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

Published 11/16/2011
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El clamp hiperinsulinémico euglucémico, o una pinza de insulina, es el estándar de oro para evaluar la acción de la insulina

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Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

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Abstract

La diabetes tipo 2 se caracteriza por un defecto en la acción de la insulina. El clamp hiperinsulinémico euglucémico, o una pinza de insulina, es considerado el "gold standard" método de evaluación de acción de la insulina in vivo. Durante una pinza de la insulina, hiperinsulinemia se consigue mediante una infusión de insulina constante. Euglucemia se mantiene a través de una infusión de glucosa concomitante a una tasa variable. Esta tasa de infusión de glucosa variable (GIR) se determina mediante la medición de glucosa en la sangre a intervalos breves durante todo el experimento y el ajuste de la RGI en consecuencia. El GIR es un indicativo de acción de la insulina en todo el cuerpo, como los ratones con una mayor acción de la insulina requieren un mayor GIR. La pinza de la insulina puede incorporar la administración de dos isótopos [14 C] desoxiglucosa para evaluar los tejidos específicos de la captación de glucosa y [3 - 3 H] glucosa para evaluar la capacidad de la insulina para suprimir la tasa de aparición de glucosa endógena (Endora), un marcador de producción de glucosa hepática, y para estimular lavelocidad de desaparición de glucosa en todo el cuerpo (Rd).

La miniaturización de la abrazadera de la insulina para su uso en modelos de ratón genéticos de las enfermedades metabólicas ha dado lugar a avances significativos en la investigación de la diabetes. Métodos para la realización de las abrazaderas de insulina varía entre laboratorios. Es importante señalar que la forma en que se lleva a cabo una pinza de insulina pueden afectar significativamente los resultados obtenidos. Hemos publicado una evaluación exhaustiva de los diferentes enfoques a la realización de las abrazaderas de insulina en ratones conscientes 1, así como una evaluación de la respuesta metabólica de las cuatro cepas de ratón común innato usando varias técnicas de pinza 2. Aquí se presenta un protocolo para la realización de las abrazaderas de insulina en ratones conscientes, sin restricciones desarrollada por la Vanderbilt ratón fenotipo metabólico Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC). Esto incluye una descripción del método para la implantación de catéteres utilizados durante el clamp de insulina. El protocolo empleado por laVanderbilt MMPC utiliza un diseño único de dos catéter 3 del sistema. Un catéter se inserta en la vena yugular para infusiones. Un segundo catéter se inserta en la arteria carótida, lo que permite tomar muestras de sangre sin la necesidad de restringir o manejar el ratón. Esta técnica proporciona una ventaja significativa para el método más común para la obtención de muestras de sangre durante las abrazaderas de insulina, que es muestra de la punta de la cola cortada. A diferencia de este último método, el muestreo de un catéter arterial no es estresante para el ratón 1. También se describen métodos para el uso de infusiones isotópica de seguimiento para evaluar los tejidos específicos de acción de la insulina. También se proporcionan directrices para la presentación adecuada de los resultados obtenidos a partir de las abrazaderas de insulina.

Protocol

1. Preparación de los catéteres y la antena del ratón para el acceso de muestreo (MASA tm)

  1. Prepare un catéter arterial mediante la inserción de un trozo de 1,3 cm PE-10 (0,011 pulgadas de diámetro interno) en una pieza de 6 cm de tubo de silastic (0,012 pulgadas de diámetro interno), como se muestra en la Figura 1A. Bisel de la punta de la PE-10 con un bisturí para la duración de la final de la silastic a la punta del bisel es de 0,9 cm.
  2. Prepare catéter venoso deslizando una pieza de 1 mm de tubo de silastic (0,020 pulgadas de diámetro interior) 1,1 cm desde el extremo biselado de una pieza de 6 cm de tubo de silastic (0,012 pulgadas de diámetro interno), como se muestra en la Figura 1B. La pieza de 1 mm de silastic se utiliza como una restricción de cuentas.
  3. Para preparar un tm MASA, insertar cada una de las dos piezas de 1,3 cm, de 25 conectores de acero inoxidable de calibre en cada una de las dos piezas de 3 cm de PE-20 (0,015 pulgadas de diámetro interno).
  4. Asegurar la PE-20/connectors el uno al otro, deslizando una pieza de 5 mm de silastictubos (0,040 pulgadas de diámetro interno) sobre el área donde los tubos de acero y PE 20 se encuentran.
  5. Doblar los tubos de acero con un ángulo de ~ 120 ° y separar cada tubo de 45 º.
  6. Lugar terminó en la plataforma de una masa de adhesivo de silicona médica, que el PE-20 tubos es vertical y los extremos de los tubos de acero inoxidable se extienden más allá del adhesivo (fig. 1C). Permitir que esto fijada para las 24 horas.

2. Cateterismo quirúrgico

  1. Antes de la cirugía, esterilización de los catéteres con etanol al 70%, llenarlos con solución salina heparinizada (200 U de heparina / ml de solución salina) y la conexión de una clavija de acero inoxidable.
  2. Anestesiar a ratones, de preferencia utilizando un método que continuamente proporciona el agente anestésico (por ejemplo, el isoflurano inhalado).
  3. Utilizando una técnica estéril, quitar el pelo de los sitios de incisión con tijeras y / o una crema depilatoria y desinfectar la piel con alcohol seguido de una exfoliación betadine. La inserción de catéteres, eliminar el vello en laregión que se extiende desde la mandíbula inferior a la parte superior de la caja torácica y entre las clavículas. De externalización de los catéteres detrás de la cabeza, eliminar el vello en la zona comprendida entre la base del cráneo y la región interescapular y desinfectar la piel con alcohol seguido de una exfoliación betadine.
  4. Coloque el ratón sobre la espalda en una superficie de calentamiento y en el área de visualización de un microscopio quirúrgico. Asegure la cola y las extremidades con cinta quirúrgica. Asegurar la cabeza en el cono de la nariz la entrega de la anestesia.
  5. Haga una pequeña incisión vertical la línea media de 5 mm cefálica con el esternón. Con unas pinzas, contundente disecar el tejido para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo. Reflejan este músculo para exponer la arteria carótida izquierda. Suavemente se burlan de tejido conectivo de la arteria. Es importante en este momento para aislar el nervio vago de la arteria, sin dañar la arteria o el nervio.
  6. Aislar la arteria y ligar el extremo cefálico con sutura de seda. Nudo suelto otrapedazo de sutura en el extremo caudal del vaso expuesto.
  7. Clamp vaso con una pinza de micro-serrefine en el extremo caudal y corte justo debajo del extremo ligado con unas tijeras de primavera. Introduzca con cuidado del catéter hasta la abrazadera. Con cuidado, suelte la abrazadera micro-serrefine y avanzar el catéter hasta el cruce de silastic-PE.
  8. Ate los dos ligaduras de forma segura a la sonda y confirmar que las muestras del catéter mediante la conexión del extremo libre de la sonda a una jeringa de muestreo.
  9. Hacer otra incisión de 5 mm a la derecha de la línea media y alrededor de 2 mm de caudal a la primera incisión. Con unas pinzas, contundente disecar el tejido para exponer y aislar la vena yugular derecha.
  10. Cuidadosamente ligar el extremo cefálico con sutura de seda y corbata suelta otro pedazo de sutura en el extremo caudal.
  11. Corte justo debajo de la ligadura cefálica con unas tijeras de primavera e inserta el catéter hasta la restricción de cuentas. Atar una sutura detrás de la bola y confirmar que las muestras del catéter.
  12. Turn el ratón por encima y hacer una pequeña incisión entre los omóplatos.
  13. Túnel de una aguja de calibre 14 debajo de la piel de la incisión del catéter arterial, en la parte frontal del ratón, a la incisión en la parte posterior interescapular. El catéter arterial a través de la aguja para exteriorizar en la parte trasera del ratón. Repita esto para el catéter de la vena yugular por un túnel de la aguja de calibre 14 debajo de la piel en el lado derecho del ratón en el sitio de la incisión en la parte frontal de la incisión interescapular en la espalda.
  14. Fije el catéter arterial con una pinza de micro-serrefine en el sitio de la incisión entre los omóplatos. Cortar el catéter ~ 1 cm por encima de esta pinza. Coloque el tm MASA con los conectores de acero inoxidable mirando hacia la cabeza del ratón. Conectar el catéter en la arteria en el conector de acero inoxidable, apuntando hacia el lado izquierdo del ratón. Tener cuidado de asegurarse que no hay agujeros o torceduras en el catéter. Repita el procedimiento para el catéter venoso,que lo conecta al conector de acero inoxidable que apunta hacia el lado derecho del ratón.
  15. Inserte el tm de MASA en la incisión entre los omóplatos. La tubería de PE-20 correspondiente al catéter yugular debe ser hacia el lado derecho del ratón y el PE-20 correspondiente a la tubería del catéter arterial se debe a la izquierda.
  16. Cerrar las incisiones ventral y dorsal con sutura de nylon. Para el cierre dorsal, la sutura se puede ejecutar a través de la silicona endurecida de la tm MASA para asegurarlo en su lugar. Confirmar la permeabilidad de los catéteres con una solución de lavado que contiene solución salina heparinizada y un antibiótico para reducir al mínimo el riesgo de infección. Lugar del ratón en una jaula caliente y limpio para la recuperación inmediata. La figura 2 muestra el producto terminado.
  17. Permitir el ratón para recuperar por lo menos 5 días. Controlar el peso y la salud en general. Utilizar el postoperatorio adecuado régimen analgésico aprobado por Cuidado de Animales de la institución yUse Comité.

3. Hiperinsulinémico euglucémico pinza

  1. Rápido con el ratón para el 5-6h. Como referencia, el tiempo t = 0 min se refiere al fin del ayuno y el comienzo de la infusión de insulina y glucosa (es decir, período de la pinza).
  2. La línea de tiempo de instalación y para un experimento típico se muestra en la Figura 3. Use tubos de Micro-Renathane o equivalente para perfusión y líneas de muestreo. Suspender a un giro de doble canal por encima del mouse. Esto sirve como un centro de entre el ratón y las jeringas de infusión / muestreo. Durante el experimento, el ratón se mantiene en una jaula o contenedor similar y está unido a la pieza giratoria.
  3. Antes de conectar el ratón, rellene la línea de muestreo arterial con solución salina heparinizada (10 U de heparina / ml de solución salina) y el lugar de un conector de acero inoxidable en el extremo inferior de la línea. Deja una jeringa con solución salina heparinizada (jeringa de compensación) conectado a la parte superior de la línea de muestreo. Esto será utilizado para elaborar la sangre samples.
  4. Llene la línea de infusión venosa con solución salina no heparinizada de partida desde el puerto de la infusión de la rótula (segmento A en la Figura 3) todo el camino hasta la parte inferior de la línea. Conecte el extremo superior de la línea y el lugar de un conector de acero inoxidable (o un conector en Y si un bolo se administra) en el extremo inferior de la línea. Si un trazador isotópico de glucosa (por ejemplo [3 - 3 H] glucosa) se está infundiendo, obtengan una jeringa de 1 ml que contiene el marcador a una jeringa de infusión. Llene la línea de infusión venosa con marcador en lugar de solución salina (Figura 3B).
  5. Tres horas en el ayuno, peso del ratón y conecte el PE-20 de la vena yugular y catéteres arteriales para la infusión y las líneas de muestreo, respectivamente.
  6. Si la administración de [3 - 3 H] trazador de glucosa, iniciar una infusión preparada trazador continuo en t = -90 min (Figura 3C). Una primera serie de dosis típica es de 1 Ci. Prepare un 0,05 Ci / l [3 - 3 H] glucosa solution en solución salina no heparinizada. Cargue la solución en una jeringa de 1 ml y segura la jeringa en una bomba de infusión. Administrar la dosis de cebado mediante la infusión de 20 l / min durante 1 min. Seguir con una infusión continua de 0,05 Ci / min (1 l / min) por un período de 90 minutos de equilibrio.
  7. Preparar infusiones de insulina y glucosa. La insulina se prepara en solución salina no heparinizada que contiene 3% de plasma como un portador (una concentración adecuada de la BSA también se puede utilizar). Infusiones de glucosa están comercialmente disponibles en una variedad de concentraciones (% 5, 20 y 50).
  8. Preparar solución salina lavado infusión erythorocyte mediante la obtención de toda la sangre de un ratón de donantes, de preferencia de la misma cepa de fondo como el ratón experimental. Normalmente 1 ml de sangre total que se necesita por ratón de estudio. Centrifugar la sangre a los eritrocitos por separado. Lavar los eritrocitos con 10 U / ml de solución salina heparinizada y centrifugar para descartar la solución salina. Determinar el volumen de eritrocitos y resuspender en un volumen igual de 10 U / ml heparinized solución salina.
  9. Dibuja cada infusión en una jeringa de 1 ml y seguro cada jeringa para una bomba de infusión individual. Conecte cada jeringa a un conector de 4 vías (Figura 3).
  10. En t = -15 min tomar una muestra de sangre poco a poco la elaboración de 50 a 100 l de sangre en la jeringa de compensación. Abrazadera de la línea de muestreo arterial y retire la jeringa de compensación. El uso de un medidor de glucosa en mano, tome una lectura de glucosa en sangre mediante la eliminación de la pinza en la línea de muestreo arterial y permitiendo que la sangre fluya hacia la franja de medidor de glucosa.
  11. Una vez que la medición de la glucosa se toma, fijación de la línea de muestreo arterial e insertar una jeringa con aguja roma (jeringa de muestreo) en la línea de muestreo arterial. Retire la abrazadera y extraer un volumen de sangre (ver nota) con la jeringa de muestreo. Abrazadera de la línea de muestreo arterial y retire la jeringa de muestreo. Inserte la jeringa claro de nuevo en la línea de muestreo arterial. Elaborar el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire y volver a infundir el50-100 l de sangre que se redactó originalmente.

Nota: El volumen de las muestras de sangre depende del análisis que se realiza. Por ejemplo, el análisis de [3 - 3 H] la concentración de glucosa requiere de 10 l de plasma, así que 50 l de sangre se extraen. Esto resulta en 20 a 30 l de plasma, lo cual es suficiente para el análisis de plasma más si fuera necesario. Las mediciones de hormonas y otros metabolitos (por ejemplo, la insulina, los ácidos grasos libres) requieren muestras de sangre adicionales.

  1. Prescindir de la sangre en la jeringa de muestreo en un microtubo EDTA recubiertos. Centrifugar y recoger el plasma. Mantener el plasma en el hielo hasta el final del estudio o tienda de inmediato a -20 ° C.
  2. Repita los pasos del 3,10 por 3,12 en t = -5 min. Obtener sangre adicional (50 l) para la medición de los niveles basales de insulina en plasma. Medida de referencia hematocrito por la extracción de sangre en un tubo capilar con heparina o EDTA tratos. Las mediciones obtenidas from muestras de plasma en el instante t = -15 y -5 min representan basal (en ayunas, es decir) los valores.
  3. Después de la muestra en el instante t = -5 minutos, llenar las líneas de infusión de eritrocitos glucosa, insulina y suero salino lavada hasta el conector de 4 vías. Conecte el conector de 4 vías con el tubo conectado al puerto de la infusión de giro (o el tubo conectado al conector Y si la infusión de [3 - 3 H] glucosa) como se muestra en la Figura 3.
  4. Comience la infusión de solución salina los eritrocitos lavados primero. Establecer la velocidad de infusión para reemplazar el volumen total de sangre que se muestra a lo largo de la duración del estudio (por ejemplo, si un total de 500 l de sangre se muestra a lo largo de 120 minutos de estudio, establecer la velocidad de infusión de 4,2 l / min). En contraste con las infusiones, la solución de eritrocitos es de color rojo. La infusión de esta primera solución permite que cualquier posible resistencia u obstrucción en las líneas de infusión para ser identificados y corregidos.
  5. Una vez que la infusión de eritrocitos alcanza el ratón, inicie la insulina yinfusiones de glucosa. Esto es ahora t = 0 min. La insulina es infundida a una velocidad constante, pre-determinada tasa. Una tasa de infusión de insulina de 4 mU • kg -1 • min -1 normalmente suprimen la producción de glucosa endógena por 80-100% y estimular la desaparición de la glucosa por 2-3 veces. La tasa de infusión de glucosa inicial (GIR) se calcula sobre la base de los niveles de glucosa basal de sangre y la experiencia previa.
  6. Si la infusión [3 - 3 H] glucosa, se puede optar por aumentar la velocidad de infusión de trazador para que coincida con el aumento estimado de la facturación de glucosa (por lo general un aumento de 2-3 veces).
  7. Teniendo en cuenta la alta tasa de rotación de la glucosa en el ratón, las muestras de sangre se debe obtener de la línea arterial al menos cada 10 minutos para la medición de la concentración de glucosa durante la duración del experimento. Ajuste la RGI para lograr y mantener la euglucemia objetivo (Figura 3C). Este objetivo puede variar dependiendo del modelo o los objetivos del estudio. Un buen objetivo glucose concentración es de 150 mg • dl-1 ya que este es un típico nivel de glucosa en ayunas 6 horas para un ratón chow-alimentados C57Bl/6J.
  8. El objetivo es alcanzar la euglucemia rápidamente, a ser posible dentro de los primeros 40-50 minutos, y tener la glucosa estable y GIR por el inicio del período de estado estable (t = 80 min).
  9. Si la infusión [3 - 3 H] glucosa, obtener sangre adicional en t = 80, 90, 100, 110 y 120 minutos para la medición de plasma [3 - 3 H] glucosa en la actividad específica.
  10. Recoger la sangre adicionales en t = 100 y 120 minutos para la medición de la insulina plasmática y cualquier otra hormona (s) o metabolito (s). En t = 110 min, extraer la sangre en un tubo capilar con heparina o EDTA tratados para la medición de la abrazadera de hematocrito.
  11. Después de la muestra en t = 120 min se toma, 2 [14 C] desoxiglucosa puede ser administrado para la medición de los tejidos específicos de la captación de glucosa. Administrar un bolo de 12 Ci en la línea de bolo conectado a la línea de muestreo yugular (Figura 3B
  12. Obtener muestras de sangre (50 l) de la línea de muestreo arterial en t = 2, 15, 25 y 35 min después de la administración del bolo para la medición de plasma 2 [14 C] Los niveles de desoxiglucosa.
  13. Después de la última muestra, anestesiar el ratón con una inyección de pentobarbital administra directamente en la línea arterial. Diseccionar rápidamente los tejidos necesarios para la evaluación de la absorción de glucosa (por ejemplo, los músculos esqueléticos de varios tipos, tejido adiposo, corazón, cerebro) y otros tejidos (por ejemplo, hígado, bazo, riñones). Ajustar los tejidos congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis. Glucosa en el tejido se analiza mediante la medición de la acumulación de fosforilados 2 [14 C] desoxiglucosa en los tejidos congelados y la desaparición de dos [14 C] desoxiglucosa del plasma.

4. Resultados representante

Un ejemplo de los resultados obtenidos de un experimento clamp de insulina se muestra en la Figura 4.Este ejemplo muestra la capacidad de una dieta alta en grasas a la resistencia a precipitar la insulina en ratones. Todas las presentaciones de los resultados de la abrazadera de insulina debe incluir lo siguiente para ser interpretable: un curso de tiempo de los niveles de glucosa en la sangre, un curso temporal de la RGI y los niveles plasmáticos de insulina (basal y pinza). Como se muestra aquí, la glucosa en ayunas (Figura 4) y la insulina (Figura 4C) los niveles son más altos en los ratones alimentados con una dieta alta en grasas, lo que indica resistencia a la insulina. La presentación de un curso temporal de los niveles de glucosa durante todo el estudio de sujeción (Figura 4) permite al lector evaluar qué tan bien euglucemia se mantuvo, lo cual es indicativo de la calidad de la pinza. Del mismo modo, un curso temporal de la RGI (Figura 4) permite que el lector para determinar con qué rapidez un estado de equilibrio se alcanzó. Mostrando estos datos como los cursos de tiempo es mucho más informativo que la práctica convencional en la literatura del ratón clamp de insulina de la presentación de un experimento de 2 horascomo un punto de referencia único que representa los valores medios de un indefinido "pinza" período (4-13). En el presente ejemplo, los niveles de glucosa eran iguales entre el control y grupos de alto en grasa alimentadas, pero la GIR fue significativamente menor en el alto contenido de grasa grupo alimentado (Figura 4B). Esto es indicativo de un deterioro en la acción de la insulina en todo el cuerpo. Abrazadera de los niveles de insulina también fueron más altos en el alto contenido de grasa grupo alimentado (Figura 4C), más el apoyo de la presencia de un fenotipo de resistencia a la insulina en los ratones. El uso de infusiones de trazador isotópico permite la evaluación de la acción de la insulina en los tejidos específicos. [3 - 3 H] glucosa se ​​utiliza para estimar la tasa de aparición de glucosa endógena (Endora), que es un índice de la producción hepática de glucosa (PGH) y la tasa de desaparición en todo el cuerpo la glucosa (Rd). Mientras que la insulina suprime completamente PGH en los ratones de control, este se encuentra alterada en los ratones alimentados con una dieta alta en grasa (Figura 4D). Del mismo modo, la capacidad de deinsulina para estimular Rd en los ratones de control se ve comprometida en los ratones alimentados con una dieta alta en grasa (Figura 4). 2 [14 C] desoxiglucosa se ​​utiliza para evaluar el índice metabólico de glucosa (RG), una medida de tejidos específicos de la captación de glucosa. Como se ve en este ejemplo, la insulina estimula la captación de glucosa en el músculo esquelético se encuentra alterada en los ratones alimentados con una dieta alta en grasa (Figura 4F).

Figura 1
Figura 1: Preparación de la arterial (A) y (B) y los catéteres venosos (C) tm MASA. Catéteres arteriales son preparados por la inserción de una pieza de 1,3 cm de PE-10 de unos 3 mm en una pieza de 6 cm de 0,012 "silastic ID. La punta de la PE-10 está biselado de tal manera que la longitud del bisel al silastic es de 0,9 cm. Venosa Los catéteres se hacen deslizando una pequeña pieza de 0.020 "ID silastic 1,1 cm desde el extremo biselado de una pieza de 6 cm de 0,012" silastic ID. Los 0.020 "actos ID silastic pieza como un cordón de restricción para sí curar el catéter en la vena yugular. Para el montaje de la tm MASA, cada uno de los dos 1,3 cm de calibre 25 conectores se inserta en cada una de las dos piezas de 3 cm de PE-20. Estos se mantienen unidos por una pequeña pieza de 0,040 "silastic ID. Los conectores están dobladas a un ángulo de 120 ° y separados en un ángulo de 45 °. Todo el conjunto está inmerso en adhesivos de silicona médica.

Figura 2
Figura 2: ratón sondaje. Los catéteres son implantados quirúrgicamente en la arteria carótida izquierda y la vena yugular derecha. Los extremos libres de los catéteres se externalizan detrás de la cabeza y conectado a un tm MASA. La tm MASA se inserta por vía subcutánea entre los omoplatos. Esto permite un acceso vascular durante los experimentos de clamp de insulina sin la necesidad de restringir, controlar o anestesiar al ratón.

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Figura 3: Representación de la línea de tiempo de instalación y para un experimento clamp de insulina. El ratón es atado a un giro de doble canal que actúa como un centro de infusión y jeringas de muestreo. Configuraciones típicas para los experimentos no uso de infusiones de trazador (A) y el uso de ambas [3 - 3 H] glucosa y 2 [14 C] desoxiglucosa (B) se muestran. Una línea de tiempo de los procedimientos de creación y la realización de la abrazadera de la insulina (C) también se muestra. Durante la abrazadera, las muestras de sangre ( sangre ) Se toman cada 10 minutos para medir la glucosa en la sangre. El GIR se ajusta en consecuencia para mantener la euglucemia. Las muestras de glucemia basal en sangre, insulina en plasma, y el plasma [3 - 3 H] glucosa se ​​toman en t = -15 y -5 min. Las muestras para la abrazadera de plasma [3 - 3 H] glucosa se ​​toman en t = 80, 90, 100, 110 y 120 y la abrazadera de la insulina en el instante t = 100 y 120 min. 2 [14 C] desoxiglucosa se ​​administra después de la muestra en t = 120 min, y blood se recoge en el instante t = 2, 15, 25 y 35 minutos después. Los tejidos son tomadas después de la muestra t = 35 min.

Figura 4
Figura 4: Resultados de un experimento pinza comparar la insulina en los ratones con una dieta control (Chow) a ratones con una dieta alta en grasas (HFD). Curso del tiempo de la glucosa arterial (A) y la insulina GIR (B), de referencia y la abrazadera (C), Endora (D), y Rd (E) y el músculo esquelético (gastrocnemio y vasto externo) Rg (F) se muestran. Todos los resultados indican que el efecto de la alimentación alta en grasas para inducir resistencia a la insulina.

Discussion

El clamp hiperinsulinémico euglucémico, o una pinza de insulina, es considerado el "gold standard" método de evaluación de acción de la insulina in vivo. Esta técnica se ha aplicado a varias especies incluyendo a los humanos, perros, ratas y ratones. Dado el creciente número de modelos de ratones transgénicos para los trastornos metabólicos, la miniaturización de la técnica para su uso en el ratón ha establecido avances significativos a la investigación del metabolismo.

Mientras que los conceptos detrás de la abrazadera de insulina son sencillas, en la práctica existen diferentes enfoques para llevar a cabo experimentos de insulina abrazadera. Esto no es un punto trivial, ya que la forma en que se lleva a cabo el experimento afecta a los resultados obtenidos 1. Aquí presentamos el protocolo utilizado por el MMPC Vanderbilt. La diferencia fundamental entre el protocolo y la de otros es que el uso de un catéter arterial para la obtención de muestras de sangre. Esto está en contraste con el enfoque más ampliamente utilizado del TBOaining muestras de sangre por la ruptura de la punta de la cola de 4, 7, 11, 12, 14-17. La ventaja del muestreo de un catéter arterial es que el experimento se lleva a cabo en un ratón consciente y sin restricciones. Toma de muestras de la cola a menudo requiere moderación y aumenta los índices de estrés, cuando las grandes muestras de sangre se obtienen 1. Las hormonas del estrés estimulan la producción de glucosa endógena y poner en peligro la utilización de glucosa 18, 19, que puede dar la apariencia de un fenotipo de resistencia a la insulina. Toma de muestras de la cola cortada puede requerir un cuidado especial de Animales institucional y la aprobación del Comité uso debido a su naturaleza estresante. El procedimiento de cateterismo arterial fue desarrollado para evitar el estrés en el ratón de la corte de la cola.

Un aspecto clave de la realización de las abrazaderas de insulina es la capacidad para mantener la euglucemia. No hay algoritmos que puede predecir correctamente cómo la RGI debe ser ajustado en base a las lecturas de glucosa en sangre. Al igual que la cirugía,personal de la realización de experimentos de insulina pinza ser competente en el mantenimiento de la euglucemia razonable sólo a través de la experiencia. Es importante señalar que debido a su mayor tasa metabólica de los datos obtenidos de los estudios del ratón será inherentemente ruidosos. Esto hace que la presentación completa de los datos, incluidos los cursos de tiempo de la glucosa y la RGI y los valores absolutos de la insulina plasmática, Endora, Rd y Rc crucial para la capacidad de cualquier lector a interpretar los resultados. Las tasas de flujo de glucosa en el ratón (aproximadamente 5 veces mayor que la tasa en los seres humanos) garantiza una alta frecuencia de muestreo de la glucosa. Mientras que el volumen de sangre del ratón se limita, con una frecuencia de muestreo mínima de una vez cada 10 minutos hay que estar seguro de que una pinza adecuada que se ha logrado.

Como se muestra en la Figura 4, los niveles de insulina pinza puede ser diferente entre los grupos. Factores tales como intervenciones dietéticas, manipulaciones transgénicas o las diferencias en las cepas de fondo puede afectar a fasting los niveles de insulina, que posteriormente puede afectar los niveles de insulina pinza. Interpretación de los resultados cuando los niveles de insulina son diferentes pinza puede ser problemático. Esto puede ser abordado experimentalmente mediante la realización de experiencias piloto para seleccionar las tasas de infusión de insulina que se alcancen niveles equivalentes de insulina pinza entre los grupos. Por otra parte, la somatostatina puede ser utilizado para inhibir la secreción pancreática de la hormona, la insulina y el glucagón pueden ser reemplazados en las tasas de forma experimental controlado. Este último enfoque se hace más comúnmente en las abrazaderas de insulina en las ratas que los ratones. Si estos enfoques experimentales no se toman, la RGI en estado estacionario se puede normalizar con el nivel de insulina en pinza, o un índice de sensibilidad a la insulina (S I) se pueden derivar de los datos de pinza como I = S GIR / (G • ΔI), donde G es la concentración de glucosa en estado estable y ΔI es la diferencia entre el ayuno y las concentraciones de insulina pinza. Una de las hipótesis con uno u otro enfoque es que el nivel de insulina pinza se logradentro del rango donde es linealmente sensibilidad a la insulina relacionada con el nivel de insulina de acuerdo con el grupo estudiado. Este último supuesto no se puede aplicar cuando se comparan los resistentes a la insulina y los grupos sensibles a la insulina. Idealmente, una dosis de insulina curva de respuesta se debe generar para seleccionar la infusión de insulina adecuada. Sin embargo, debido a la necesidad de experimentos adicionales, esto se hace raramente.

La versatilidad proporcionada por cateterismo arterial se extiende a los métodos experimentales más allá de las abrazaderas euglucémico. Por ejemplo, pinzas de hiperglucemia, en la que la glucosa es infundida a una velocidad variable para mantener la hiperglucemia en relación con la glucosa en ayunas, se puede utilizar para evaluar la función pancreática endógena en vivo 2, 20, 21. La medición de la secreción de insulina primera fase durante esta prueba requiere la adquisición frecuente de muestras de sangre (es decir, cada minuto 2-5), que no es viable en la obtención de muestras de la punta de la cola. Por otra parte,catecolaminas elevados derivados del muestreo cola puede afectar la secreción de insulina y mejorar la secreción de glucagón 22. El protocolo de clamp de insulina también puede ser modificado para permitir que los niveles de glucosa a caer a la hipoglucemia relativa para evaluar la contra-reguladoras de respuesta de 2, 23, 24. Cateterización arterial también puede ser utilizado para evaluar la dinámica del metabolismo de la glucosa durante el ejercicio 25-30. Esto es una ventaja significativa sobre los métodos convencionales a cabo en los puntos sola vez antes y después del ejercicio o en vivo aislado ex músculos. Las técnicas presentadas aquí también se puede utilizar para evaluar no sólo la glucosa, sino también el metabolismo de ácidos grasos 31.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el subsidio de 5 U24-DK059637-10 al Centro de ratón Vanderbilt fenotipo metabólico.

References

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  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

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