Avslører Neural Circuit Topografi i Multi-Color

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi tilbyr en praktisk guide for å levere sporstoffer

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nevrale kretsene er organisert i funksjonelle topografiske kart. For å visualisere komplekse krets arkitekturen vi utviklet en tilnærming til pålitelig merke den globale fordelingen av flere topografiske projeksjoner. Lillehjernen er en ideell modell for å studere ordnet arrangement av nevrale kretser. For eksempel har compartment organiseringen av spinocerebellar mosegrodde fibre vist seg å være en uunnværlig system for å studere mosegrodde fiber mønster. Vi har nylig viste at hvetespirer agglutinin (WGA) konjugert til Alexa 555 og 488 kan brukes til å spore spinocerebellar mosegrodde fiber anslagene i å utvikle og voksne mus (Reeber et al. 2011). Vi fant tre store egenskaper som gjør at WGA-Alexa tracere ønskelig verktøy for merking nevrale projeksjoner. Først Alexa fluorophores er intense og deres lysstyrke tillater wholemount bildebehandling rett etter tracing. Sekund, label WGA-Alexa tracers hele banen for å utvikle og voksen nevrale projections. Tredje, WGA-Alexa sporstoff raskt transporteres i både retrograd og anterograd retninger. Her beskriver vi i detalj hvordan man skal forberede sporingsstoffene og andre nødvendige verktøy, hvordan å utføre kirurgi for spinocerebellar sporing og hvordan man best bilde spores anslagene i tre dimensjoner. Oppsummert kan vi tilby en steg-for-steg tracing-protokollen som vil være nyttig for å tyde organisering og tilkobling av funksjonelle kart ikke bare i lillehjernen, men også i cortex, hjernestammen og ryggmargen.

Protocol

1. Levere sporstoffer in vivo ved hjelp av sterile kirurgi (§ § 1.1 til 1.16)

Gjennom hele prosedyren anbefaler vi at standard sterile kirurgiske teknikker brukes. Dette inkluderer bruk av sterile hansker, kappe, og ansiktsmaske. Verktøy skal enten autoklaveres før bruk eller rengjøres grundig med vann og etanol. Under operasjonen, og spesielt mellom dyr, rene vev fragmenter av verktøy og tørre sterilisere instrumenter med en varm perle sterilisator (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). I tillegg er det viktig at du organisere arbeidet plass slik at du har områder utpekt for dyr forberedelse (barbering etc), kirurgi, og en utvinning område der dyret lett kan overvåkes, varmet, og leveres med analgetika etter behov. Nøkkelen til vellykket overlevelse surgeries er å redusere risikoen for infeksjon og opprettholde en aggressiv postoperativ behandling strategi. Vennligst henvis til tabell der du kan find alt nødvendig utstyr og reagenser for denne protokollen.

  1. Anesthetize voksen mus med nylagede Avertin (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St. Louis MO;. Cat # T48402) via en intraperitoneal (ip) injeksjon med en dose på 0.2ml/10grams kroppsvekt. Andre anestetika som isofluran eller ketamin / xylazin er like effektive, men sørge for at laboratoriet har de nødvendige institusjonelle og føderal godkjenning før bruk. Hvis du bruker unger (P0 - P10) kan du anesthetize dem på knust is i 10-15 minutter. Sørg for at huden av hver valp er ikke i direkte kontakt med isen (for eksempel ved å plassere dem i fingrene av lateks hansker) som det kalde vannet vil raskt føre til en dødelig grad av hypotermi. Bekrefte at dyret er under en akseptabel sletten av anestesi ved å utføre en tå klype med pinsett eller fingrene til dyrenes hind poter. Hvis det er en pedal refleks, vente til dyret er ikke responderer på denne stimulus som en indikasjon på et dypereren av anestesi.
  2. Når dyret er helt bedøvet legge den med dorsal siden opp på et sterilt gasbind pad med hodet vendt bort fra deg, og halen vendt mot deg. Barbere pels med hårklippere for å gi deg selv et klart kirurgisk felt som er bredt nok til å få tilgang til det sentrale nervesystemet. Tørk av barbert regionen med to sett av alkohol våtservietter, deretter 70% alkohol / betadine, og rengjør gang med alkohol våtservietter. Bruk en innsiden til utsiden sirkelmønster ved rengjøring av kirurgiske området. Du kan velge å tydelig markere dine kirurgiske feltet ved å skjære et lite hull i en steril gaskompress og plassere åpningen over barbert og rent kirurgiske området. Selv opprettholde sterile kirurgiske feltet kan være vanskelig når de opererer på små dyr, men dette vil bidra til å redusere risikoen for infeksjon.
  3. Løft huden ved hjelp av pinsett og gjøre et snitt med saks på midtlinjen rett over den nedre thorax-øvre lumbal region. Den nedre torakale region-øvre korsryggen kan identifiseres ved å kjøre fingeren langs ryggvirvlene til å føle for en hump i ryggsøylen (Fig. 1).
  4. Kutt fascia og overfladisk spinal muskler. Om nødvendig, stoppe blødninger ved cauterizing blodkarene (Fine Science Tools, Foster City, CA;. Cat # 18000-00). I unger, søker mildt press rundt snittet med bomullspinner er tilstrekkelig for å stoppe blødning.
  5. Utfør en dorsal laminektomi ved å fjerne spinous prosesser av en eller to deler av nedre torakal - øvre lumbal ryggmargen etter kutte lamina på begge sider av virvelsøylen, midt mellom artikulære prosessen og dorsal spinous prosessen (Fig. 2) . Vær forsiktig så du ikke skader på ryggmargen med saks og alltid fjerne den lille bein fragmenter som de kunne lage rift i ryggmargen. Merk at ryggsøylen i tidlig postnatal unger ikke er helt ossified, noe som betyr at bein er sværtmyk og kan bli kuttet veldig enkelt. Derfor være forsiktig med å kutte for dypt da dette kan skade ryggmargen.
  6. Hvis du ikke ønsker å utføre en dorsal laminektomi i voksen mus, har vi funnet ut at du kan skjære det myke vevet mellom ryggvirvel segmenter for å avdekke en liten region i ryggmargen uten å kutte noen bein. Selv om begge metodene er effektive ruter trådt i ryggmargen, kan unngå en dorsal laminektomi sikre at ryggmargen forblir uskadet.
  7. Fyll en dro glass elektrode (borsilikatglass kapillærer, Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Dual scenen Glass mikropipette Puller fra Narishige Model 001-PC-10) med sporstoff ved hjelp av en mikrometer sprøyte (0.2ml; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) eller en tilsvarende leveranse apparat.
  8. Stram glasset microelectrode på plass på en micromanipulator og sett elektroden 0.1-0.5mm inn i den nedre thorax-øvre lumbal regionen av ryggmargen halvveis mellom midtenlinje og den laterale kanten av ryggmargen. Dyret kan holdes i en stereotaxic apparat for nøyaktig identifisering av injeksjon loci og for å stabilisere dyret (Small Animal Stereotaxic Instrument Model 940-A og elektrode manipulator Model 960 fra Kopf Instrumentation). Alternativt, hvis du bedøvelse regime kan skreddersys for å oppnå en jevn fly uten betydelige bevegelser på grunn av dyp pusting, forsiktig taping dyret ned nok.
  9. Trykk injiserer inn i ryggmargen over 3-5 minutter ca 0.5μl av en 2% løsning av WGA-Alexa 488 (hvetespirer agglutinin, Alexa Fluor 488 konjugat;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, California), WGA-Alexa 555 (hvetespirer agglutinin, Alexa Fluor 555 konjugat;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, California), WGA-Alexa 350 (hvetespirer agglutinin, Alexa Fluor 350 konjugat;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, California), WGA- HRP (hvetespirer agglutinin pepperrot peroksidase, Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) eller 0.5μl på 10%BDA (biotinylert dekstran amin;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, California) i fosfatbufret saltvann (PBS, Sigma, St. Louis, MO, Cat # P4417). Injisering av disse volumene av sporstoffer resulterer i merkingen et stort antall fibre. Mindre volumer må injiseres for målretting mindre kjerner (eller sub-regioner av individuelle kjerner) og hver etterforsker bør empirisk bestemme den ideelle volumet for å levere. Iontophoresis bør vurderes for nøyaktig nanoliter levering for presis injeksjoner. Vi vanligvis supplement alle tracer løsninger med 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO, Cat # F7252) for å visualisere injeksjonen stedet under operasjonen.
  10. Vi legger 1μl av maisolje (Sigma, St. Louis, MO, Cat # C8267) til hver 10μl av BDA løsning før injisering for å hindre at blandingen fester seg til veggene i trukket pipetter. Hvis du har problemer med å mate den tracer ut av pipetten, sakte trekke spissen for å lage en liten lomme i vevet deretter prøve å injisere igjen.Det er ikke uvanlig at microelectrode tips å tette. I de fleste tilfeller lommen bidrar også lage et reservoar hvorfra de omkringliggende nevroner kan absorbere tracer. Husk å alltid løse ut tracer sakte for å unngå massive vevsskader i nærheten av nålen din.
  11. Forsiktig nær huden med sår klipp og vev lim. Alternativt kan du bruke sting for å lukke såret.
  12. Merk at med praksis den kirurgiske prosedyren, i hvert fall frem til dette punktet, kan gjennomføres på mindre enn 20 minutter.
  13. Plasser dyret i et recovery kammer (Vetcare kammer modell 9.16.0 Cat. # 340508 fra Harvard Apparatus) på en oppvarming pad (Heating Pad Cat. # 341241 fra Harvard Apparatus) for å unngå nedkjøling og raskere restitusjon. Alternativt kan du bruke en av mange fabrikater og modeller av oppvarming kamre. Overvåk pustefrekvens og se etter tegn på at dyret forsøker å flytte. De fleste dyr er vanligvis responsive innen 10-15 minutter etter kirurgi.
  14. 555 WGA-Alexa, WGA-Alexa 488, og WGA-HRP er raskt transporteres i nevroner og vi har funnet ut at i både tidlig postnatal og voksne musene Alexa konjugert tracers robust label lange fiber traktater innen 24 timer (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 er også raskt transportert selv i forhold til de andre Alexa fargestoffer synligheten er svært avhengig av kvaliteten og følsomhet filter sett (data ikke vist;. Reeber et al 2011) BDA krever vanligvis lengre overlevelse ganger å fullt spore nevrale projeksjoner og derfor for fullstendig kartlegging av spinocerebellar projeksjoner dyr må ofres etter ca 11 dager.

2. Påvisning av anterogradely spores mosegrodde fibre

  1. Etter de respektive overlevelse periodene anesthetize musene med Avertin (eller foretrukket bedøvende).
  2. Når det ikke er noen reflekser blodet skal skylles gjennom hjertet av perfusing med 0.1m PBS (pH7.2). Deretter fikse vevet ved perfusing dyret med 4% Paraformaldehyde (PFA) i PBS. I tillegg til de regionene du vil analysere, er det alltid nødvendig å skaffe vev fra injeksjonsstedet for retrospektiv analyse av hvor store injeksjonen var en indikasjon på omfanget av vevsskade forårsaket av elektroden, og for å identifisere mulige merking i fibre av passasje (Fig. 3, se Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Postfix i brains fra perfused mus for 24-48 timer i 4% PFA og deretter cryoprotect dem i bufret sucrose løsninger fortynnet i PBS (15% for ~ 2 timer eller til vevet synker til bunnen av beholderen og deretter 30% over natten eller til vev vasker). Vevet blir deretter fjernet fra sukrose, forsiktig tørket tørt med tørkepapir og så midt i en vev muggsopp inneholder OCT (Optimal Cutting Temperature; Sakura Finetech USA Inc, CA). Vevet blir deretter frosset ved hjelp av en -80 ° C fryseboks og lagret ved samme temperatur før den er klar til å bli kuttet.
  4. Den Alexa fluorophores er synlige rett etter merking og ikke krever ekstra farging. Derfor, etter perfusjon WGA-Alexa spores vev kan kuttes og monteres for imaging eller direkte avbildes i 4% PFA som wholemount forberedelse. Vi fant at avbildning vevet i 4% PFA ga det beste brytningsindeks for avbildning av topografien på spores anslagene i wholemounts. For seksjoner, klippe serial 40μm tykt Coronal seksjoner på en cryostat og samle dem som frittflytende seksjoner i PBS. Gitt toksisitet av PFA, sikre at en passende ansiktsmaske er slitt under perfusjon og bildebehandling, holde området godt ventilert, og når den ikke brukes umiddelbart returnere alle PFA eller PFA-fiksert vev til lukkede beholdere. Den er ideell hvis mikroskop er plassert i en passende avtrekksskap.
  5. WGA-HRP merket fibre kan bli avdekket ved hjelp tetrametylbenzidin (TMB) som kromogenløsningen. Vi vil ikke beskrive HRP flekker protokollen her siden det har tidligere blitt beskrevet i detalj (Vogel og Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. For BDA merket fibre inkuber frittflytende vev seksjoner i 2 timer i Streptavidin-CY3 (Kat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, California) eller Streptavidin-Alexa Fluor 488 eller 555 (Kat. # S11223 for 488 og Cat. # S21381 for 555, Invitrogen, Carlsbad, California), vask i PBS og deretter montere med fluoro-GEL. For DAB, inkuber vev seksjoner overnatting i ABC reaksjon buffer (Kat. # PK-4000, VEctor Laboratories, Inc. Burlingame, CA), skyll 3 ganger i PBS og deretter reagere i 5-10 minutter i DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) supplert med 10μl på 30% H 2 O 2 for hver 50ml DAB løsning.

3. Immunhistokjemi

  1. Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere (Sillitoe et al. 2008). Kort, inkuber vev seksjoner i 0.1m PBS som inneholder 10% NGS (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 og primære antistoffer (se nedenfor) for 16-18 timer ved romtemperatur. Vask vevet seksjoner tre ganger i PBS og deretter inkuber dem i sekundære antistoffer (se nedenfor) for maksimalt 2 timer i romtemperatur. Skyll vev igjen og avsløre immunoreaktivitets som beskrevet nedenfor.
  2. Å bestemme forholdet mellom Purkinje celler og mosegrodde fibre vi co-merket frittflytende vev seksjoner med konvensjonelle metoder for dobbel farging. Vi brukte WGA-Alexa 555for sporing og Alexa 488 konjugert esel anti-mus sekundære antistoffer (Invitrogen / molekylære prober Inc., Carlsbad, California) for å oppdage ZebrinII (1:250; Kind gave fra Dr. Richard Hawkes, University of Calgary, Calgary, Canada). ZebrinII er et monoklonalt antistoff og ble brukt direkte fra tilbrakte hybridoma kultur medium. Fluoroforen og konjugert sekundære antistoffer ble brukt ved en fortynning av 1:1500. Etter flekker vevet seksjonene var montert på belastes glass-slides og deretter coverslipped med fluoro-GEL i Tris-buffer (Elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA) eller med Vectashield hardset montering medium med DAPI (Kat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) for trippel farge fluorescens imaging.
  3. Vi testet spesifisiteten av sekundære antistoffer ved å behandle vevet seksjoner i fravær av primære antistoffer. Ingen signal ble oppdaget i en slik kontroll eksperimenter, noe som indikerer at farging vi observerte var ikke på grunn av uspesifikke signaler fra the Alexa-konjugerte antistoffer (data ikke vist).

Fire. Mikroskopi og dataanalyse

  1. Vi fange photomicrographs vev seksjoner bruke Leica DFC360 FX (fluorescens) og DFC490 (DAB og TMB reagerte vev seksjoner) kameraer montert på en Leica DM5500 mikroskop.
  2. Vi erverve og analysere bildene av vev seksjoner bruke Leica Application Suite og Leica Application Suite FX programvarepakker.
  3. Photomicrographs av wholemounts er tatt med en Leica DFC3000 FX kamera montert på et Leica MZ16 FA stereomikroskop kjører Leica Application Suite FX programvare.
  4. Begge våre mikroskoper er utstyrt med Leica CY3 (modell # 11600231) og FITC (modell # 11513880) filtre, og DM5500 med en ekstra A4 DAPI / UV filter (modell # 11504162).
  5. Bildene er ervervet etter å optimalisere for under / over-eksponering som bestemmes ved hjelp av Leica programvare. Vi importerer alle rådata til Adobe Photoshop CS4 og om nødvendig we riktig hele feltet av hvert bilde for skarphet, lysstyrke, kontrast eller nivåer bare. Andre fotoredigering programvare kan brukes som foretrukket.
  6. Den schematics presenteres her ble trukket i Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 og CY3 beiset nevroner, som er oppdaget så rødt bruke vår filtre, var pseudo-farget magenta i bildene som presenteres gjennom hele manuskriptet.

Dyr

Alle dyrestudier ble utført under en godkjent IACUC dyr protokollen i henhold til de institusjonelle retningslinjer ved Albert Einstein College of Medicine. Mannlige og kvinnelige outbred sveitsiske Webster (Taconic, Albany, NY) eller innavlet C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) mus ble opprettholdt i koloni vårt og brukes for alle studier. Noon på dagen en vaginal plug ble oppdaget ble ansett embryonale dag 0,5.

5. Representant Resultater:

Spinocerebellar afferenter si inn parasagittal band i lillehjernen (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat og Eisenman 1995; Vogel og Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps og Hawkes 2009, Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Vi injisert WGA-Alexa sporingsstoffene inn i den nedre thorax-øvre lumbal ryggmargen for å demonstrere: 1) at disse tracere kan brukes til å konsekvent label spesifikke undergrupper av terminaler i lillehjernen (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). at WGA-Alexa sporstoff intenst lyse og kan brukes til å visualisere den generelle mønsteret av mosegrodde fiber topografi i hele cerebella (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) at WGA-Alexa 488 og 555 kan benyttes i kombinasjon for sporing flere trakter i samme dyr (Fig. 4), og 4) at WGA-Alexa sporstoffer er kompatible med immunhistokjemisk farging (Fig. 5). I de senere arbeid viste vi at WGA-Alexa sporstoffer label terminaler i lillehjernen så tidlig som 6 timer etter levere sporstoff i ryggmargen og er et utmerket valg for å spore Arkitekture å utvikle baner (Reeber et al., 2011).

Figur 1
Figur 1. Oppsett av utstyr for å levere sporstoffer in vivo. A. Et bilde av vår kirurgiske området. B. Den nedre torakal-øvre korsryggen kan identifiseres ved å kjøre fingrene langs ryggvirvlene til å føle for en hump i virvelsøyle. Den dorsale laminektomi bør utføres omtrent i midten av "hump", som er indikert av den gule pilen.

Figur 2
Figur 2 Illustrasjon av en lavere torakal -... Øvre lumbal vertebrale segment før og etter dorsal laminektomi A. Skjematisk fremstilling av en intakt ryggvirvel segment fra lavere-thorax-øvre tømmer regionen musen ryggvirvel kolonne B. A dorsal laminektomi utføres ved å fjerne spinous prosesser av en eller to ryggvirvel segmenter, etter å kutte lamina midt mellom artikulære prosessen og dorsal spinous prosessen.

Figur 3
Figur 3. WGA-Alexa sporstoff intenst lyse og kan brukes til å visualisere afferent projeksjon topografien i høy oppløsning. A. skjematisk illustrerer opprinnelse og opphør av WGA-Alexa 555 merket spinocerebellar nevroner. B. Bilde av en injeksjonsstedet etter å ha levert WGA-Alexa 555 inn i den nedre thorax øvre korsryggen av den voksne ryggmargen. C. Wholemount bilde av anterior lobules etter en injeksjon av WGA-Alexa 555 inn i den nedre thorax-øvre lumbal regionen av ryggmargen. D. WGA-Alexa 555 anterograd sporing av spinocerebellar tarmkanalen avslører band av mosegrodde fibre som sett på en coRonal vev delen. Den lobules defineres av romertall og tallene etiketten mosegrodde fiber band på hver side av midtlinjen (gjelder alle bilder). Scale barer: B, 500 mikrometer C, 500 mikrometer D, 200 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. WGA-Alexa sporstoff effektive for merking av flere nervebaner i samme dyret. A. Wholemount skjematisk av musen lillehjernen oppsummerer det generelle mønsteret av spinocerebellar mosegrodde fiber band. WGA-Alexa 555 ble sprøytet inn i høyre side av korsryggen ryggmargen og WGA-Alexa 488 i samme segment på venstre side. B. Som sett på en koronale vev seksjon skjære gjennom posterior lobules, var begge WGA-Alexa sporstoffer transporteres til lillehjernen og hell merkes tydelig undergrupper av terminaler (se også Reeber et al. 2011). Forkortelser: muldvarpcular lag (ml); Purkinje celle lag (PCL); granule celle lag (GCL), hvit substans (WM). Scale barer: B, 100 mikrometer.

Figur 5
Figur 5. WGA-Alexa tracere kan brukes i kombinasjon med immunhistokjemi og histologi for trippel merking av nevroner og projeksjoner. A. WGA-Alexa 555 avsettes i mosegrodde fiber terminaler i lobule III. B. ZebrinII flekker avslører en rekke Purkinje celle striper i lobule III. C. DAPI farging av neuronal og glial kjerner. D. Sammenslåtte bilde av paneler A, B , og C viser triple merking av afferent band, Purkinje celle striper, og generelt cytoarchitecture. EH. Høy forstørrelse bilder av eske regionene er vist i paneler AD. Purkinje celle striper er nummerert som tidligere beskrevet (anmeldti (Apps og Hawkes 2009)). Forkortelser: molekylært lag (ml); Purkinje celle lag (PCL); granule celle lag (GCL). Scale barer: D, 500 mikrometer (for AC), H, 500 mikrometer (for EG).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet det kirurgiske og tekniske detaljer som kreves for vellykket aksonal og dendrite sporing ved hjelp av en roman fluorescerende tilnærming for rask merking nevrale anslagene i utvikling og voksne mus. Ved hjelp av WGA-Alexa viser vi hvordan sporstoffer og markører kan brukes for å analysere mønstrede krets topografien i høy oppløsning og i tre dimensjoner.

Mange sporstoff tilgjengelig for sporing nevrale kretser inkludert koleratoksin subenhet B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald og fluorogold. I tillegg har nyere genetisk og viral baserte sporstoffer demonstrert at molecularly distinkt neuronal undergrupper er topografisk knyttet til sine mål med stor presisjon. Merk at selv om noen nevrale sporstoff hovedsakelig transporteres i enten anterograd eller retrograd retning (f.eks BDA 10 000 mw versus 3000 MW), er sporstoff molekyler ofte transportert i beggeretninger. I våre studier, innfører vi WGA-Alexa baserte sporstoffer som pålitelig nevroanatomi verktøy for analyser av topografiske projeksjon mønstre. Vi viser at WGA-Alexa fluoresces lyst, transporteres raskt, og er allsidig nok til å være sammen med immunhistokjemiske markører inkludert de lillehjernen sagittal avdelinger (Fig. 3).

Vi har funnet flere begrensninger ved bruk av WGA-Alexa i forhold til andre tilgjengelige nevroanatomi sporstoffer. I motsetning til BDA (Wu et al. 1999), vi tidligere viste at WGA-Alexa (og WGA-HRP) ikke avsløre hele morfologi av komplekse terminal avslutninger (Reeber et al. 2011). Imidlertid forbedret vi verdien av den anatomiske informasjonen han fikk fra spores terminaler ved sammenkobling WGA-Alexa tracing med immunhistokjemisk farging for vesikulært glutamat Transporter 2 (VGLUT2) og kokain og amfetamin regulert transkripsjon peptid (CART) immunhistokjemi (Reeber et al 2011;. Reeber og Sillitoe, 2011). Enandre brist av WGA-Alexa er at signalet brytes forholdsvis raskt på vev seksjoner, til tross for at montert i media som beskytter fluorescerende signal. Derfor har vi typisk bilde vevet umiddelbart etter skjæring, selv om bildebehandling innen 2 dager for å kutte fortsatt lar merkede fibre og terminaler for å være vellykket avbildes. Det er en tendens til at WGA-Alexa signal å tape intensitet under farging av vev seksjoner. Bruk færre og kortere vasker under flekker kan minimere dette problemet. En annen anbefaling er å alltid montere og bilde ett sett av de spores vev seksjoner på dagen for å kutte for en referanse satt til å sammenligne med tilstøtende seksjoner som vil bli behandlet for immunhistokjemi. I våre hender OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) embedded tissue blokker oppbevares ved -80 ° C etter perfusjon og cryoprotection kan lagres i lengre perioder uten tap av tracer intensitet.

Våre approach av tracing fibre kan lett tilpasses for sporing nevrale kart i cortical, hjernestammen, og spinal veier. Vi er for tiden utforsker muligheten for å bruke WGA-Alexa sporstoffer for in vivo avbildning av kretsen formasjonen i genmodifiserte dyr og for å studere dynamikken i kretsen dannelsen etter selektiv tarmkanalen lesjoner og farmakologiske manipulasjoner. Siden rask transport av WGA-Alexa tracere tillater kortsiktig analyse vår tilnærming har potensial for å avdekke de dynamiske endringer som oppstår under strukturell plastisitet av topografiske kretser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av ny etterforsker oppstart midler fra Albert Einstein College of Medicine ved Yeshiva University for å RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
  4. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. (2011).
  5. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. (2011).
  6. Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
  7. Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
  8. Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
  9. Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
  10. Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
  11. Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics