Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De identificatie van hersentumor initiëren cellen (BTICs), de zeldzame cellen binnen een heterogene tumor bezit stamcel eigenschappen, geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen tumor pathogenese. We hebben verfijnd specifieke kweekomstandigheden te verrijken voor BTICs, en we routinematig gebruik van flowcytometrie om verder te verrijken deze populaties. Zelfvernieuwing en assays transcript analyse door eencellige RT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd op deze geïsoleerde cellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hersentumoren bestaan ​​typisch uit diverse cellen die morfologisch verschillende neurale lineage markers drukken. Slechts een relatief klein deel van de cellen in de tumor met stamcel eigenschappen genoemd hersentumor inleiding cellen (BTICs) bezitten het vermogen om te differentiëren langs diverse lineages, zichzelf te vernieuwen en initiëren tumoren in vivo. We pasten kweekomstandigheden oorspronkelijk gebruikt voor normale neurale stamcellen (NSC's) om een ​​verscheidenheid van humane hersentumoren en dat deze cultuur methode die specifiek kiest voor steelachtige populaties. Serumvrij medium (NSC) zorgt voor de instandhouding van een ongedifferentieerde stamcel staat, en de toevoeging van bFGF en EGF maakt de verspreiding van multi-potente, zelfvernieuwende en uitbreidbaar tumorspheres.

Verder te karakteriseren elke tumor BTIC bevolking evalueren we celoppervlaktemarkers door flowcytometrie. We kunnen ook sorteren populaties van belang zijn voor meer specifieke characterizatie. Zelfvernieuwing assays worden uitgevoerd op enkele BTICs gerangschikt in platen met 96 putjes, de vorming van tumorspheres na incubatie bij 37 ° C geeft de aanwezigheid van een stengel of progenitor cel. Meerdere mobiele nummers van een bepaalde populatie kunnen ook worden gesorteerd in verschillende putten voor het beperken van verdunning analyse, tot zelfvernieuwing capaciteit te analyseren. We kunnen differentiële genexpressie ook bestudeerd in een bepaalde celpopulatie met enkele cel RT-PCR.

De volgende protocollen beschreven onze procedures voor de dissociatie en kweek van primaire humane monsters verrijken BTIC populaties en de dissociatie van tumorspheres. Ook zijn protocollen voor kleuring voor flowcytometrie analyse of sorteren, zelfvernieuwing assays en cel RT-PCR.

Introduction

Hersentumoren behoren tot de meest agressieve en heterogene kanker bekend bij mensen. Hoewel hun vroegere opsporing en diagnose zijn vergemakkelijkt door moderne neuro-imaging-technologie, hebben we nog steeds geen curatieve therapieën voor vele hersentumoren, met name voor diffuse, invasieve die of die diep in de hersenen.

Hersentumoren vormen de belangrijkste oorzaak van kankersterfte bij kinderen als gevolg van hun zeer agressieve en vaak ongeneeslijke aard. Glioblastoma (GBM), de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen, is een van de meest agressieve humane kankers, gevreesd voor het gelijkmatig fatale prognose 1. Deze zeer kwaadaardige tumor astrocytaire (WHO-graad 4) treedt meestal op in de cerebrale hemisferen van volwassenen, en kan ook voorkomen bij jonge kinderen en zuigelingen. De groei is snel en infiltratieve, en diagnostische pathologische kenmerken zijn nucleaire pleomorfisme, microvasculaire proliferatie en necrose 2,3. Voor Adults met nieuw gediagnosticeerde glioblastoma, mediane overleving verlengt zelden langer dan 12 maanden 1, met over het algemeen een slechte antwoorden op alle therapeutische modaliteiten. Wij stelden vast dat er vele functionele en genetische overeenkomsten gedeeld door somatische stamcellen en kankercellen en de moleculaire mechanismen die de normale ontwikkeling van de hersenen reguleren vaak ontregelde in kanker. Bij de toepassing stamcelbiologie paradigma voor de studie van hersentumoren waren we de eersten die prospectief identificeren en zuiveren een subpopulatie van cellen uit humane GBMS die stamcellen eigenschappen van proliferatie, zelfvernieuwing optrad en differentiatie in vitro 4 en vivo 5. We toegepaste kweekomstandigheden en assays oorspronkelijk normale neurale stamcellen (NSC's) te karakteriseren in vitro 6,7 meerdere pediatrische en volwassen hersentumoren en verrijkt voor deze stam-achtige cellen door celsortering de neurale voorlopercellen celoppervlaktemarker CD133 8 ,9. De CD133 + hersentumor fractie bevatte cellen die een veel hogere frequentie van tumorinitiatie hadden dan de CD133-fractie in NOD-SCID muizenhersenen 5,10. Dit formeel vastgelegd dat alleen een zeldzame subset van hersentumor cellen met stamcellen eigenschappen zijn tumor-initiërende, verdienen ze de naam "hersentumor initiëren cellen" of "BTICs". De nieuwe identificatie van BTICs geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen ontstaan ​​van tumoren, waardoor sterke steun voor de kankerstamcel hypothese 10 tot 13 ​​als basis voor vele solide tumoren, en stelt een nieuwe cellulaire doel voor een meer doeltreffende kankertherapieën 14-20. Therapieën gericht op het doden van de bulk van de tumor kan de zeldzame steelachtige fractie missen, waardoor de tumor blijft groeien. Therapieën die zich richten op het doden van de kankerstamcel kan een betere behandeling en de prognose voor patiënten met hersentumoren te bieden.

Met het oog op BTIC populaties te bestuderen, hebben we verfijnd onze cultuopnieuw protocollen om specifiek te kiezen voor celpopulaties binnen de menselijke hersentumoren die stamcellen eigenschappen bezitten. Serumvrij, neurale stamcellen (NSC) medium maakt het onderhoud van een ongedifferentieerde stamcel toestand, en de toevoeging van basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermale groeifactor (EGF), en leukemie inhiberende factor (LIF) maakt de proliferatie van multi-potente, zelfvernieuwende, en uitbreidbaar menselijke tumorspheres. Hier beschrijven we de methoden van verwerking van primaire hersentumoren en kweken ze in NSC medium te verrijken voor BTIC populaties. We noemen ons experimenteel modelsysteem "BTIC patiënt isolaten" het feit dat deze cellen slechts minimaal stam gekweekt onder benadrukken celomstandigheden te selecteren op stamcelpopulaties. latere immunolabelling van BTIC populaties voor belangrijke stamcel markers zoals CD15 en CD133 en flowcytometrie analyse wordt ook beschreven. Vervolgens bespreken we de beperkende verdunning analyse,die helpt bij het bestuderen van de zelfvernieuwing potentieel van BTICs. Tot slot onderzoeken we de genexpressie analyse van deze zeldzame cellen door het sorteren enkele cellen op AmpliGrid dia's en het uitvoeren van enkele cel RT-PCR. Deze technieken zijn ook toepasbaar op andere hersentumoren zoals medulloblastoom, ependymoom en pediatrische gliomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultuur van hersentumor Tissue

  1. Voeg 200 ul ontdooid Liberase (Roche Applied Science) tot 15 ml van kunstmatige CSF (aCSF-zie tabel 1) en breng het in 37 ° C waterbad. Liberase TM is een mix van proteolytische enzymen gebruikt om primaire weefselmonsters, evenals gekweekte tumorspheres dissociëren. Anders trypsine-EDTA, de Liberase werkwijze behoudt het oppervlak antigeen CD133. Een weefselmonster van ongeveer 0,5 cm3, we 200 ul Liberase. Als het weefsel kleiner, wij 100 ul.
  2. Breng ammoniumchloride-oplossing (Stem Cell Technologies) op kamertemperatuur. Ammoniumchlorideoplossing lyseert voorzichtig rode bloedcellen met minimale effecten op andere cellen. Het bevat geen fixeermiddel.
  3. In steriele biologische veiligheid kast, voeg 5 ml aCSF om specimen container, zwenk om weefsel te spoelen, daarna uit pipetteer. Deze stap helpt bij het verwijderen van rode bloedcellen (RBC).
  4. Overdracht hersentumor weefsel een steriele 100 mm Petri dish.
  5. Met behulp van fijne schaar of mes en tang, splitsen weefsel op drijfmest consistentie.
  6. Verzamel monster met behulp van een 10 ml gewone pipet of een tang en overdracht fragmenten in de buis met voorverwarmde aCSF met Liberase.
  7. Plaats op incubator-shaker (30 rpm) en op 37 ° C, gedurende 15 minuten.
  8. Filter het weefsel lysaat door 70 pm cel zeef in een 50 ml Falcon buis.
  9. Draai het filtraat neer op 280 xg gedurende 5 minuten.
  10. Verwijder voorzichtig supernatant en evalueren grootte en kleur van de resulterende celpellet: korrels die roze of rood geven steeds meer rode bloedcellen.
  11. Hersuspendeer pellet in 1 ml PBS.
  12. Voeg een geschikte hoeveelheid ammoniumchlorideoplossing (4-12 ml) op basis van korrelgrootte en rode cellen besmet (de ammoniumchlorideoplossing is zeer zacht en grotere hoeveelheden niet schadelijk zijn voor andere cellen dan rode bloedcellen).
  13. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  14. Spin-cellenvastgesteld bij 280 xg gedurende 5 minuten.
  15. Was eenmaal met 10 ml steriel PBS.
  16. Resuspendeer in 5 ml NSC compleet medium (tabel 2) en breng een ultra-lage bindingsaffiniteit 60 mm weefselkweekplaat (Corning). We maken gebruik van ultra-lage binding kweekplaten met covalent gebonden hydrogel oppervlakken die zijn hydrofiel en neutraal geladen, om celhechting-gemedieerde differentiatie te minimaliseren.

Voor de eerste dagen in cultuur, veranderen niets aan de media: top-up alleen met 1-2 ml media als nodig is, ga dan verder met de cultuur en verandering media te observeren wanneer de kleur van de media wordt iets geel.

2. Tumorsphere Dissociatie voor flowcytometrie

  1. Evalueer tumorspheres onder microscoop: als het gebied afmetingen> 100 pm, dissociatie wordt aanbevolen als grotere bollen kunnen necrotisch in het midden.
  2. Overdracht cultuur 15 ml conische buis.
  3. Voeg 2-3 ml steriel PBS grondig te spoelen plaat en toe te voegen aan conische buis.
  4. Centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten.
  5. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 - 2 ml steriele PBS.
  6. Voeg 10 ul Liberase.
  7. Incubeer in 37 ° C waterbad gedurende 3 minuten. Verwijder en visueel te beoordelen vering, als er meerdere groepjes gezien, voorzichtig vermalen met behulp van een 1.000 ul pipet tip.
  8. Als klonteren blijft voordoen, ga incubatie voor een extra 1-2 min.
  9. Spoel de cellen door toevoeging van 5 ml steriel PBS en centrifugatie bij 280 xg gedurende 5 minuten.
  10. Verwijder supernatant en resuspendeer in 500-1000 pi steriel PBS +2 mM EDTA.
  11. Beoordeel aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van trypan blauw.
  12. Stel celtelling tot 1 miljoen / ml in PBS +2 mM EDTA.

3. Oppervlakte Staining

  1. Breng 100 pi van 1x10 6 / ml celsuspensie per test 12x75 mm stromingsbuizen.
  2. Voeg het juiste hoeveelheid antilichamen. Matched Isotype controles moeten worden voor iedereantilichaam (zie tabel 3).
  3. Incubeer gedurende 30 min op ijs.
  4. Voeg 2 ml PBS + 2 mm EDTA Aan een aanvoer buis.
  5. Centrifugeer op 200 xg gedurende 4 min, decanteren en blot.
  6. Hersuspendeer pellet in 300 pi PBS +2 mM EDTA.
  7. Voeg 10 ul 7AAD levensvatbaarheid kleurstof aan elke buis en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
  8. Analyseren door flowcytometrie.

4. Flowcytometrie Acquisitie en analyse

De bijzonderheden van registratie en analyse van stroomgegevens zijn instrument-afhankelijk. Representatieve negatieve monsters worden uitgevoerd en de instellingen opgericht voor Forward (grootte) en Side (granulariteit) verstrooien. Dit scatter patroon kan de eindgebruiker om alle cellen te bekijken in het monster, met inbegrip van afval. Een gebied wordt gewoonlijk getrokken rond de cellen van belang. (Figuur 4a) De instellingen worden dan vastgesteld voor alle fluorescentie detectoren nodig zijn om de negatieve cellen te positioneren binnen het eerste decennium van afluorescence intensiteit plot. Wanneer meer dan een kleurstof of fluorochroom wordt gebruikt, moet enkel glas controles worden uitgevoerd om kleurcompensatie waarden (aftrekken van storende fluorescentie-emissie) vast te stellen. Bij het ​​uitvoeren levende cellen, een levensvatbaarheid kleurstof zoals 7-AAD (7-amino-actinomycine D - excitatie 488/emission 655) wordt gebruikt en een tweede gebied gemaakt van dode cellen (figuur 4b) te sluiten. Beide gebieden worden toegepast om verdere analyse van de monsters.

5. Zelfvernieuwing Assay

De belangrijkste test die sterk wordt vergemakkelijkt door klonale bol groei is de in vitro test van zelfvernieuwing capaciteit de beperkende verdunning assay. Tumorspheres kunnen worden gescheiden door en verspreid bij verdunningen tot een enkele cel per goed, en de snelheid van de daaropvolgende bol formatie meer dan 7 dagen in cultuur wordt berekend. Op dag 7, wordt het percentage wells zonder sferen voor elke cel plating dichtheid (F 0) berekend en uitgezettegen het aantal cellen per putje (x). Het aantal cellen noodzakelijk om ten minste een tumorsphere in elke well te vormen wordt bepaald door het punt waar de lijn de 0,37 niveau (F 0 = e-x). In een Poisson verdeling van cellen, F 0 = 0,37 komt overeen met de verdunning van een cel per well, zodat deze berekening (37% snijden) de frequentie van Monogene stamcellen in de gehele celpopulatie (Figuur 5) geeft.

6. Single Cell RT-PCR

Enkele cellen uit verschillende populaties worden gesorteerd op Beckman Coulter MoFlo XDP op reactie plaatsen op een AmpliGrid dia (Beckman Coulter cat # AG480F). Single cell RT-PCR wordt uitgevoerd met AmpliGrid Single One Step RT PCR-systeem (Beckman Coulter cat # OAX04515) volgens de specificaties. In het kort wordt een cel gestort elke reactieplaats een AmpliGrid slide, de aanwezigheid van een enkele cel inreactieplaats bevestigd door microscopie. Reverse transcriptie (RT) wordt onmiddellijk na sortering het monster voorkomen dat aangetast. De RT master mix wordt vers bereid volgens kit instructies (Tabel 4). We gebruikten 0,03 pi 25 pM willekeurige primers (Promega) per reactie, 1 pi master mix toegevoegd aan het midden van elke reactieplaats. Dit wordt direct bekleed met 5 ui afdichting oplossing (Beckman Coulter cat # OAX04503). Met een slide AmpliSpeed ​​cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), slides worden geïncubeerd bij 25 ° C gedurende 10 min, 42 ° C gedurende 10 min, en 55 ° C gedurende 45 minuten. Na reverse transcriptie, 3 ul DNase / RNase-vrij water wordt toegevoegd aan elke reactieplaats en het gehele mengsel overgebracht in een PCR buis (1 tube / site). In een PCR plaat, is een reactievolume van 10 ul gebruikt voor kwantitatieve PCR: 8 pi qPCR master mix (5 pi SYBR Green (Quanta), 1 pi water, 1 pi 10 pM forward en reverse primer mix) plus 2 μ l van de RT mengsel. Voor real-time kwantificering monsters uitgevoerd op een BioRad cycler met het volgende programma: 95 ° C gedurende 10 min, 45 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 60 sec, 72 ° C gedurende 60 seconden gevolgd door 10 min bij 72 ° C en smeltcurve analyse. Ct-waarden werden bepaald met Opticon Monitor 3 (BioRad). Drie genen kan worden beoordeeld per cel, met inbegrip GAPDH als huishoudgen. Genexpressie wordt genormaliseerd naar GAPDH expressie, volgens conclusie 2-ΔCt. Minstens tien afzonderlijke cellen van dezelfde populatie van dezelfde soort kan worden gebruikt als biologisch repliceert compenseren gebrek aan technische repliceert.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1 toont een Magnetic Resonance Imaging (MRI)-scan van een vertegenwoordiger patiënt met een GBM. Hersentumor monsters worden genomen van toestemming patiënten direct na de operatie, zoals goedgekeurd door de Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Research Ethics Board. Een deel van elk monster wordt aan de neuropatholoog voor routine klinische diagnose. Het resterende monster wordt verwerkt zoals weergegeven in figuur 2. De tumorcellen eenmaal uitgeplaat in volledige neurale stamcellen media met groeifactoren, tumorspheres vorm zoals weergegeven in figuur 3.

De tumorcellen worden voorzien van neurale stamcellen oppervlak markers CD133 en CD15 en geanalyseerd door flowcytometrie zoals getoond in figuur 4.

Enkele cellen van verschillende populaties bijvoorbeeld CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- worden gesorteerd in 96 putjes (figuur 5a) of in AmpliGrid slides (figuur 6a).

In de plaat met 96 putjes kunnen enkele cellen die zelfvernieuwing capaciteit (bijv. CD133 + cellen) (figuur 5b) bezitten, vormen tumorspheres (figuur 5c) na incubation. Een zelfvernieuwing grafiek kan worden uitgezet (figuur 5d) door telling van het aantal sferen gevormd per well. Enkele cellen gesorteerd in de reactieplaats van de Ampligrid schuif (figuur 6a). Het RNA geëxtraheerd uit enkelvoudige cellen kunnen reverse getranscribeerd met de Advalytix AmpliSpeed ​​(figuur 6b). De verkregen cDNA wordt gebruikt om real-time RT-PCR (figuur 6c) uitgevoerd.

Figuur 1
Figuur 1. Magnetische resonantie beeld (MRI) van een patiënt GBM. MRI-scan van de hersenen van een 16-jarig meisje met een maand-lange geschiedenis van hoofdpijn en een week geschiedenis van braken, lethargie en wazig zicht. Axiale FLAIR sequentie toont een grote bi-hemisferische ("vlinder") GBM.

Figuur 2
Figuur 2. Hersentumor verwerking. Hersentumor monsters obtaINED van toestemming patiënten direct na de operatie. Zij zijn mechanisch gedissocieerd zoals (a) en vervolgens enzymatisch gedissocieerd in aCSF met Liberase door incubatie in een 30 rpm rocking incubator bij 37 ° C gedurende 15 min (b).

Figuur 3
Figuur 3. BTIC populaties vormen tumorspheres in cultuur. Gedissocieerde hersentumor cellen uitgeplaat in volledige neurale stamcellen media met groeifactoren te vormen tumorspheres.

Figuur 4
Figuur 4. Flowcytometrische analyse van BTIC populaties. (A) Forward versus zijwaartse verstrooiing eigenschappen een beeld van alle cellen, inclusief debris (b) cellen die kleuren met de levensvatbaarheid kleurstof 7-AAD worden uitgesloten van de analyse. (C) De positie van de statistische kwadranten bepaald met behulp van geschikte isotype controles (d) Tumor cellen gekleurd met oppervlakte markers CD15-PE en CD133-APC. (D) Moflo XDP celsorteerder. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. Analyse van beperkende verdunning BTICs openbaart hun zelfvernieuwing capaciteit. (A) cellen met verschillende verdunningen worden gesorteerd in 96 putjes die 200 ul NSC tot (b) een cel per well. (C) Na een incubatie van 7 dagen termijn een tumorsphere gevormd. De morfologie van secundaire tumorspheres is identiek aan die van primaire tumorspheres. (D) De gemiddelde x-as waarden worden berekend uit beperkende verdunning analyse voor elk subtype tumor om het aantal cellen nodig is om ten minste een deel per tumorsphere goed zichtbaar.

Figuur 6
Figuur 6. Genexpressie analyse van een enkele BTIC celis mogelijk met behulp van een enkele cel RT-PCR-technologie. (a) Single cellen van een BTIC populatie kan worden gesorteerd op AmpliGrid dia's. (B) cDNA-synthese wordt uitgevoerd op enkele cellen op AmpliGrid slides met de Advalytix AmpliSpeed. (C) Quantitative Realtime PCR uitgevoerd op het cDNA gesynthetiseerd uit een BTIC cellen.

2M NaCl 62 ml
1M KCl 5 ml
1M MgCl2 3,2 ml
155 mM NaHCO3 169 ml
1M Glucose 10 ml
108 mM CaCl2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 ml

Tabel 1 Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) -. 1.000 ml.

De media Basal 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 supplement 5 ml
1M HEPES 5 ml
Glucose 3,0 g
N-acetylcysteine ​​(60 ug / ml) 1 ml
Neurale overlevingsfactor-1 (NSF-1) 10 ml

Tabel 2. Neurale stamcel media.

NSC volledige media (vers gemaakt voor gebruik):
NSC basale media + 20 ng / ml EGF (epidermale groeifactor) + 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (leukemie remmende factor) * + 10 ul / ml antibioticum-antimycoticum

* Leukemie remmende factor (LIF): Dit reagens van Millipore bevat een cytokine interleukine 6 klasse, een protein die spontane differentiatie van stamcellen bevorderen langere termijn handhaving van stamcelculturen onderdrukt.

Antilichamen Leverancier / CAT # ul / test (in 100 pl)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (Isotype controle) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (Isotype controle) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabel 3. Flow antilichamen.

Bestanddeel Volume (1 reactie) Volume (48 reacties)
2x Single Cell RT-reactie Buffer 0,50 ul 30,0 ul
RNase Inhibitor (10 U / pl) 0,02 ul 1,2 pl
5X Single Cell RT enhancer 0,15 ul 9,00 ul
Single Cell RT Enzym Mix 0,04 ul 2,4 pl
Advablue (OAX04227) 0,1 pl 6,00 ul
Nuclease gratis water vul aan tot 1 pl vul aan tot 60 ul

Tabel 4. Samenstelling van RT master mix voor Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kankerstamcel hypothese 10, op basis werk leukemie 21, borstkanker 11 en hersenkanker 4,5, blijkt dat slechts een relatief klein deel van de cellen in de tumor, kanker stamcellen genoemd, het vermogen om uitgebreid prolifereren en zelf bezitten -vernieuwen. De meeste tumorcellen verliezen het vermogen om te prolifereren en zichzelf te vernieuwen als te differentiëren in cellen die de fenotypische handtekening van de tumor. Het vinden van de sleutel cellen in de hersenen tumor bevolking die in staat zijn om de tumor te behouden geven inzicht in het mechanisme van de hersenen tumorigenese en zal ons in staat stellen om terug te traceren naar de cel van oorsprong.

Stamcellen worden functioneel gedefinieerd als zelfvernieuwende cellen die multi-differentiatie lijn 22-24 vertonen. Primaire hersentumor weefsel gekweekt onder kweekomstandigheden die stamcellen groei bevorderen, die eerder voor isolatie van neurale stamcellen tumorspheres 6,26. Ongeacht pathologische subtype binnen 24 tot 48 uur van primaire kweek meeste hersentumoren geven een minderheid van cellen die groei aantonen in klonaal afgeleide neurosfeercellen-achtige clusters of tumorspheres. Aldus kunnen wij verrijken BTIC populaties van patiënt hersentumor weefsels.

De komst van multi-parameter fluorescent geactiveerde celsortering 27 en 28 monoklonale antilichaam technologie heeft geleid tot de zuivering van kankerstamcellen gebaseerd op celoppervlaktemerkers. Door het gebruik van stamcellen merkers zoals CD133 en CD15, hebben we in staat geweest om prospectief sorteren voor specifieke stamcel-achtige populaties en hun zelf-vernieuwing capaciteit onderzoeken door het uitvoeren van beperkte verdunning assays. Een caveat van zelf-vernieuwing assays werd ingeleid door een recente studie waaruit blijkt dat in vitro zelfvernieuwing niet altijd correleren met tumorvorming in muismodellen 29. Maar onze recente werk heeft aangetoond dat in vitro zelfvernieuwing assays niet correleren met overleving van de patiënten, waardoor deze testen waardevol voor de lopende studie van BTIC biologie 30.

Werken met primaire menselijk weefsel biedt vele technische uitdagingen. Tissue verwerking moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen te behouden. De hoeveelheid Liberase gebruikt en incubatietijd is kritisch. Flow sorteren van cellen kunnen worden geoptimaliseerd om na sorteren levensvatbaarheid te verhogen door verschillende nozzles en drukken. Wij vinden dat onze cellen de voorkeur aan worden gesorteerd door middel van een 100 urn mondstuk bij 30 psi schede druk. Sorteren op Ampligrid dia reactieve plaatsen kan enigszins moeilijk: het is belangrijk om te bevestigen de aanwezigheid van de afgezette cel door microscopie.

31. Hersentumoren bestaan ​​typisch uit diverse cellen die morfologisch verschillende neurale lineage markers drukken. Studie van hersentumoren door traditionele histopathologie slechts opgeleverd beperkte kennis van het klinisch gedrag van de tumor. Hoewel grote vooruitgang geboekt in het begrijpen van de moleculaire genetische veranderingen van sommige hersentumoren 3,32-34 name medulloblastomen en maligne gliomen, en enkele van de bedoelde veranderingen beginnen nu behandeling te sturen, is het niet duidelijk of alle tumor cellen equivalent in hun vermogen om tumorgroei te handhaven. Analyse van de belangrijkste genen die betrokken zijn bij signaal transductie in hersentumor populaties is van cruciaal belang voor ons begrip van afwijkende mechanismen die leiden tot hersen tumorvorming bevorderen. Zelfs in een schijnbaar homogenenous weefsels, cellen blijken te zijn uniek in hun potentiële capaciteiten. Analyse van transcript en eiwit expressie in enkele cellen blijkt dat er een grote cel-cel variaties zowel in de rusttoestand en bij blootstelling aan stimuli 35-39. Daarom zal de analyse van de gehele populatie van cellen niet onthullen het gedrag van een enkele cel. qRT-PCR wordt beschouwd als de gouden standaard voor kwantificatie mRNA 40-41 zijn. In deze studie demonstreren we potentiële sortering van afzonderlijke cellen van verschillende populaties AmpliGrid dia. Met enkele cel RT-PCR, kunnen we genexpressie analyse uit te voeren op een enkele cel uit een heterogene populatie, waardoor evaluatie van de biologische betekenis van een geselecteerde cel in een gemengde populatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de Ontario Institute of Cancer Research (OICR), de Terry Fox Foundation en de American Association of Neurological Surgeons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics