Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Biology

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Summary

Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer verzögerten Typ-Überempfindlichkeit (DTH)-Reaktion bei der Ratte Ohr. Dies wird durch eine Demonstration der Vorbereitung der Ratte Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der Effektor / Memory T-Zell-Antwort folgte.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine Immun-Reaktion, bei der die wichtigsten Akteure sind CCR7 - Effektor / Memory T-Lymphozyten. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer DTH-Reaktion bei der Ratte Ohr. Effektor / Memory T-Zell-Antwort - Dies ist eine Demonstration der Zubereitung von Ratten Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der CCR7 gefolgt.

Effektor / Memory T-Zell-Linie (Beeton, C J. Visualisierte Experimente, Issue 8) - Ein Adoptiv-DTH wird durch die intraperitoneale Injektion von GFP-markierten Ova-spezifische CCR7 induziert. Die Zellen werden dann erlaubt, bei der Ratte für 48 Stunden ruhen, bevor Herausforderung durch die Injektion von einem Ohr mit Kochsalzlösung (Kontrollgruppe Ohr) und die andere mit einem 1:1-Mischung von Eizellen und Ova konjugiert Texas-Red (Ova-TR) zur Visualisierung ermöglichen der ansässigen Antigen-präsentierenden Zellen.

Wir beschreiben eine Methode, Gewebe Vorbereitung nützlich für die Bildgebung die Motilität von Zellen in den tiefen Hautschichten während einer Immunantwort in Verbindung mit Visualisierung von Kollagenfasern durch Erzeugung der zweiten Harmonischen. Ear Gewebe in 5 x 5 mm Quadrate (etwas größer ist besser) geschnitten und auf Kunststoff Deckgläser mit Vetbond ™, die dann gesichert werden mit Silikonfett in einem bildgebenden Kammer und superfundiert durch Sauerstoff-Blasen Gewebekultur-Medium bei 37 ° C .

Protocol

Induktion von Adoptive DTH

Bitte beachten Sie JoVE Artikel: Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten
Christine Beeton, George K. Chandy
Institut für Physiologie und Biophysik, University of California, Irvine
J. Visualisierte Experimente, Issue 8

Hier haben wir dieses Protokoll mit Antigen (Ovalbumin), konjugiert mit Texas-Red in einem Verhältnis von 1:1 mit unmarkiertem Antigen um zur Visualisierung von Phagozyten Antigen-präsentierenden Zellen können modifiziert werden.

Ohrgewebe Ernte

  1. Euthanize der Ratte in der gewünschten Zeit-Punkt durch Verfahren in Ihrem genehmigten Tier-Protokoll beschrieben. Hier verwenden wir eine Überdosis des Narkosemittels, Isofluran. Dies ist in einem geschlossenen Behälter in einem gut belüfteten Motorhaube getan. Stellen Sie sicher, das Tier tot ist entweder durch Enthauptung durch die Eröffnung der Brusthöhle und Schneiden des Herzens.

  2. Mit großen Schere entfernen das Ohr mit einem einzigen Schnitt, möglichst nahe an den Körper des Tieres wie möglich (Abbildung 1).

    Figure_1.jpg
    Abbildung 1. Die Entfernung der Ratte Ohr

  3. Legen Sie das Ohr in einer 15 ml konische Röhrchen mit ca. 10 ml eiskaltem 1x PBS oder RPMI-1640. Halten Sie die Gewebeproben auf Eis, bis Sie bereit, um das Gewebe für die Bildgebung herzustellen sind.

  4. Bild des Gewebes so schnell wie möglich, wir finden aber, dass 1 bis 2 Stunden auf Eis keine erkennbare Wirkung auf die Zellbewegung in das Gewebe, wenn das Gewebe geerntet und abgebildet sofort verglichen.

Tissue Vorbereitung für Imaging

I. Entfernung von epidermalen und dermalen Schicht

* Hinweis: Die tiefe Hautschicht muss beibehalten werden. Wenn es richtig gemacht großen Blutgefäße bleiben erhalten und der Knorpel des Ohres nicht ausgesetzt werden. Dies ist eine schwierige Technik, vor allem, wenn es keine Entzündung (Kontrollbedingungen) und es ist hilfreich, ein Binokular verwenden.

  1. Legen Sie beide das Gewebe und Medien aus dem konischen Rohr in einer 10 cm Gewebe Kulturschale.

  2. Mit behandschuhten Händen halten die Ratte Ohr sanft an der Spitze des Ohres (distalen) mit der Dorsalseite des Ohres nach oben (Abbildung 2).

    Figure_2.jpg
    Abbildung 2. Trim Fell aus dem Ohr

  3. Mit dem Daumen auf der Oberseite des Ohrs, steady das Gewebe während der Verwendung der Spitze des geschlossenen Dumont Nr. 5 Schere, um die Dermis aus der tiefen Dermis zu trennen. Alternativ, wenn der Rand des Ohres hat einen Überhang von Haut / tiefe Dermis, kann dies mit einer Pinzette fassen und vorsichtig herausgezogen, um diese aus dem Gewebe darunter (Abbildung 3) zu trennen.

    Figure_3.jpg
    Abbildung 3. Die Entfernung der oberen Dermis

  4. Nach einem kleinen Bereich der Haut hat sich von dem darunter liegenden Gewebe abgetrennt wurde, wiederholen Sie die Schritte Trennung alternativ mit einer Schere zu schneiden zwischen den Hautschichten und Pinzette vorsichtig entfernen und Abziehen der Haut abgelöst.

  5. Expose eine 5 x 5 mm oder größere Fläche Ohrgewebe, dass mindestens 3 mm von der ersten Seite der Antigen-Injektion (Abbildung 4).

    Figure_4.jpg
    Abbildung 4. Tissue für die Bildgebung ausgesetzt

II. Sicherung Tissue Imaging zur Bühne

  1. Schneiden Sie ein Kunststoff Deckglas zu einer Größe etwas größer als vorbereitet Gewebe.

  2. Verteilen Sie eine dünne Schicht von 3M Vetbond ™ Gewebe-safe Kleber auf den Objektträger.

  3. Fassen Sie die Ecke der präparierten Gewebe (wo Sie sind nicht geeignet, Bild), von Medien zu entfernen, und tupfen Sie die Unterseite des Gewebes auf der Linse Papier oder Kym wischen, um überschüssige Medien zu entfernen.

  4. Tippen Sie auf die Kante des Gewebes auf den Leim bedeckt Schlitten (die Vetbond härtet sofort auf nassen Gewebe). Vorsichtig dehnen das Gewebe flach, mit dem anderen Ende ist der letzte, der die Folie berühren (Abbildung 5)

    Figure_5.jpg
    Abbildung 5. Berg Gewebe Slip Cover

  5. Cure den Vetbond ™ durch Umkehrung der Gewebeprobe / Rutsche und Eintauchen in ein Reservoir von Medien, so dass das Gewebe und ziehen nach unten und rund sind in einem Winkel von 45 Grad. Halten Sie das Gewebe auf den Kopf in einem Winkel hilft, überschüssigen Kleber aus Aushärtung an der exponierten Gewebeoberfläche verhindern. Kleber auf der Oberfläche des Gewebes blockiert den Laser (Abbildung 6).

    Figure_6.jpg
    Abbildung 6. Cure vetbond Gewebe glue durch Eintauchen in den Medien

    Hinweis: Die Schritte 2-5 können ein wenig Übung zu meistern. Versuchen Sie üben mit weggeworfenen oder extra Gewebestücke, bevor zum ersten Mal.

  6. Dab eine kleine Menge Silikonfett auf den unteren Rand der Folie.

  7. Legen Sie die Folie in der Perfusionskammer. Stellen Sie sicher, dass die Perfusion Medien ist fließend, 37 ° C und mit Sauerstoff versorgt, bevor Sie Gewebe. Drücken Sie vorsichtig auf die Ränder der Folie machen ein Siegel mit dem Silikonfett zwischen der Unterseite des Perfusionskammer und die Kunststoff-Deckglas.

III. Zwei-Photonen-Imaging

  1. Mit Hellfeld-Durchlicht, auf der Oberseite des Gewebes zu konzentrieren. Schalten Sie alle Lichter.

  2. Schalten Sie den Laser, PMTs wie von Ihrem Multi-Photonen-Mikroskop-System erforderlich.

  3. Second Harmonic Generation (SHG) in hoch geordneten faserige Proteine ​​(Kollagen und Myosin) erzeugt ein Signal mit der halben Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lasers. Wir verwenden Anregung bei 900 nm, was zu SHG bei 450 nm, die visualisiert werden können mit dem "blue"-Kanal des Mikroskops. SHG-Generation ist eine nicht-lineare (Zwei-Photonen-) Prozess, und bietet somit eine optische "Schneiden"-Effekt ähnlich dem der Zwei-Photonen-Anregung der Fluoreszenz. Die maximale Effizienz des SHG tritt auf, wenn die Fibrillen senkrecht zur Laser, während Fibrillen, die parallel ausgeführt werden nicht visualisiert. 1

  4. Suchen Sie einen guten Imaging-Bereich mit reichlich Zellen, stellen Sie Ihren Erwerb Bereich, so dass die Mehrzahl der Zellen in der Mitte sind und beginnen Bildgebung. Hinweis: In DTH-Reaktionen, T-Zellen und anderen Zellen infiltriert sind oft zusammen konzentriert werden, während andere Bereiche frei von infiltrierenden Zellen 2 sind. Daher kann es einige Zeit dauern, die Suche im Gewebe um die beste Gegend, um Bild zu finden.

  5. Prüfen Sie, ob die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Beurteilung Zelle Geschwindigkeit und Polarität während der Bildgebung. Verwenden Sie die niedrigste Laserleistung, dass akzeptable Bildqualität bietet, um minimal Foto-Schäden zu gewährleisten.

  6. Swap in eine neue Gewebe Vorbereitung wie nötig.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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