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Articles by Agustin Avila-Sakar in JoVE
JoVE Bioengineering
Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l'acquisition d'images
1Graduate Group in Biophysics, University of California San Francisco, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco
Visualisation des échantillons de protéines par microscopie électronique à coloration négative (EM) est devenue une méthode d'analyse structurelle populaires. Il est utile pour l'analyse structurelle quantitative, comme le calcul d'une reconstruction 3D des molécules étudiées, et aussi pour un examen qualitatif de la qualité des préparations de protéines. Dans cet article nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des grilles EM, la coloration de l'échantillon et la visualisation de l'échantillon dans un microscope électronique. Les utilisateurs novices peuvent suivre ces protocoles à utiliser facilement et négatifs EM tache comme un test de routine, en plus d'autres dosages biochimiques, pour évaluer leurs échantillons de protéines.
Other articles by Agustin Avila-Sakar on PubMed
High-throughput Film-densitométrie : Une Approche Efficace Pour Générer De Gros Volumes De Données
A construit une machine de traitement des films (robot) qui peuvent, en conjonction avec un densitomètre film disponible sur le marché, d'échanger et numériser plus de 300 photographies au microscope électronique par jour. Mise en œuvre du film robotic manipulation efficace élimine le retard et l'ennui associé à numériseurs des images lorsque les données sont initialement enregistrées sur pellicule photographique. La fonction de transfert de modulation (MTF) du densitomètre disponible dans le commerce est bien pire que celle d'un microdensitomètre haut de gamme, scientifique. Néanmoins, son ratio signal-bruit (S/N) est tout à fait excellent, ce qui permet de restauration substantielle de la production au rendement « près de perfection ». En raison de la grande surface du film standard microscope électronique qui peut être numérisé par le densitomètre commercial (jusqu'à 10 000 x 13 680 pixels avec un support correctement codé), numérisation de film automatisé offre une alternative rapide et peu coûteuse pour les caméras CCD haut de gamme comme un moyen d'acquérir de grandes quantités de données d'image en microscopie électronique.
Formation D'une Dynamique Des Microtubules Kinétochores-interface à Travers L'Assemblée Du Complexe Dam1 Anneau
Comment les protéines du kinétochore former une interface dynamique avec les microtubules est largement inconnue. Dans la levure bourgeonnante, le complexe 10-protéines Dam1 est une cible kinase Aurora, qui joue un rôle essentiel en maintenant l'intégrité du fuseau mitotique et la régulation des interactions avec le kinétochore. Ici, nous avons étudié les propriétés biochimiques de purifier Dam1 complexe. Le complexe oligomérisé en anneaux autour de microtubules. Formation de l'anneau a été facilitée par les microtubules, mais pourrait se produire en leur absence. Allèles mutants a conduit à des complexes ou partiellement assemblés contraignantes microtubules réduite. L'interaction entre les anneaux et les microtubules est médiée par les terminaisons C de deux Dam1 et alphabeta-tubuline. La formation des anneaux favorise l'assemblage des microtubules, se stabilise contre le démontage, et favorise le regroupement. Un treillis GTP-tubuline est le partenaire privilégié de liaison pour le complexe, et Dam1 anneaux peuvent présenter une mobilité latérale sur les microtubules. Ces observations suggèrent un mécanisme par lequel le kinétochore peut reconnaître et de rester attachés aux extrémités ainsi que des microtubules.
Le Complexe Dam1 Anneau Kinetochore Déplace Processively Sur Les Extrémités Des Microtubules Dépolymérisation
Chromosomes interagissent par le biais de leurs kinétochores avec des microtubules, plus fins et ils sont séparés pour les pôles du fuseau que les microtubules kinétochoriens raccourcir lors de l'anaphase A de la mitose. Les natures moléculaires et les identités des protéines de couplage qui permettent de tirer dépolymérisation des microtubules chromosomes aux pôles lors de l'anaphase ont longtemps resté inaccessible. Dans la levure bourgeonnante, le complexe de dix protéines Dam1 est une critique des microtubules contraignant composante du kinétochore que oligomérise dans un anneau de 50 nm autour d'un des microtubules in vitro. Ici on montre, avec l'utilisation d'un temps réel, à deux couleurs dosage microscopie à fluorescence, qui se déplace le complexe annulaire processively pour plusieurs micromètres à l'extrémité des microtubules dépolymérisation sans se détacher de la maille. Analyse au microscope électronique de la «fin des vues» a révélé une symétrie de 16 fois des anneaux kinétochore. Ce dispositif hors registre par rapport à la symétrie des microtubules 13 fois est compatible avec un mécanisme coulissant sur la base de une électrostatiquement couplé anneau-microtubules interface. Le complexe Dam1 anneau est un dispositif moléculaire qui peut traduire la force générée par dépolymérisation des microtubules dans un mouvement le long du réseau afin de faciliter la ségrégation des chromosomes.
