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Articles by David S. Booth in JoVE
JoVE Bioengineering
Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l'acquisition d'images
1Graduate Group in Biophysics, University of California San Francisco, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco
Visualisation des échantillons de protéines par microscopie électronique à coloration négative (EM) est devenue une méthode d'analyse structurelle populaires. Il est utile pour l'analyse structurelle quantitative, comme le calcul d'une reconstruction 3D des molécules étudiées, et aussi pour un examen qualitatif de la qualité des préparations de protéines. Dans cet article nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des grilles EM, la coloration de l'échantillon et la visualisation de l'échantillon dans un microscope électronique. Les utilisateurs novices peuvent suivre ces protocoles à utiliser facilement et négatifs EM tache comme un test de routine, en plus d'autres dosages biochimiques, pour évaluer leurs échantillons de protéines.
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Séquences Signal Actionnent L'interrupteur Catalytique De L'ARN De La SRP
La particule de reconnaissance du signal (SRP) reconnaît les chaînes polypeptidiques portant une séquence signal tels qu'ils ressortent du ribosome et puis lie à son récepteur associé à la membrane (SR), ainsi fournissant la chaîne naissante ribosome complexe à l'endoplasmic reticulum dans les cellules eucaryotes et la membrane plasmique des cellules procaryotes. SRP RNA accélère catalytiquement l'interaction des SRP et SR, qui stimule leurs activités triphosphatase (GTPase) de guanosine, conduisant à une dissociation du complexe. Nous avons constaté que même si l'activité catalytique de l'ARN SRP semblait être constitutive, SRP RNA accéléré de formation d'un complexe uniquement lorsque le SRP a été lié à une séquence de signaux. Cette étape cruciale de contrôle était masquée parce qu'un détergent généralement inclus dans la mémoire tampon de réaction a agi comme un imitateur de peptide signal. Ainsi, l'ARN SRP est un interrupteur moléculaire qui rend le moteur SRP-SR GTPase sensible aux signaux recrutement de peptide, hydrolyse du GTP de couplage au ciblage de la protéine productif.
Élément De Réponse Au VIH Rev (RRE) Diriger L'Assemblée De L'homooligomère Rev Dans Discrets Complexes Asymétriques
L'ARN est une composante essentielle structurelle de nombreux ribonucléoprotéiques (RNP) complexes, y compris le ribosome, spliceosome et des particules de reconnaissance du signal, mais le rôle de l'ARN dans l'orientation de la formation du complexe commence seulement à être exploré. Dans le cas du VIH, la réplication virale nécessite l'assemblage d'un composé de la RNP homooligomère protéine Rev et l'élément de réponse Rev (RRE) ARN de médiation à l'exportation nucléaire de ARNm viraux non épissés. Assemblée des fonctionnels Rev-RRE produit complexes par oligomérisation coopérative de Rev sur l'échafaud RRE et utilise à la fois la protéine-protéine et protéine-ARN interactions complexes à organiser avec une grande spécificité. Les structures de la protéine Rev et un complexe peptide-ARN sont connus, mais le RNP complète n'est pas, ce qui rend difficile de savoir si l'ARN définit la composition et l'architecture de Rev-ARN complexes. Ici, nous montrons que le RRE contrôle l'état oligomérique et la solubilité de Rev et guide son ensemble dans discrets Rev-ARN complexes. Données SAXS et EM ont été utilisés pour dériver un modèle structurel d'un dimère Rev lié à un RRE en épingle à cheveux essentiel et de visualiser la complète Rev-RRE RNP, démontrant que RRE ensemble de fixation des disques de homooligomères Rev en particules asymétriques, rappelant le rôle de l'ARN dans l'organisation de machines RNP plus complexes, tels que le ribosome, composé de nombreux sous-unités protéiques différentes. Ainsi, le RRE n'est pas simplement un passif échafaudage sur lequel protéines se lient, mais au lieu définit activement la composition en protéines et l'organisation de la RNP.
