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Articles by Mario J. Borgnia in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Le protocole décrit une approche à haut débit pour déterminer les structures des protéines membranaires par cryo-tomographie électronique et traitement d'images 3D. Il couvre les détails de la préparation des échantillons, collecte, traitement et interprétation des données, et se termine par la production d'une cible représentant de l'approche, le VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe. Ces procédures de calcul sont conçues d'une façon qui permet aux chercheurs et aux étudiants de travailler à distance et de contribuer au traitement des données et l'analyse structurale.
Other articles by Mario J. Borgnia on PubMed
Une Méthode De Base Pondérée De Montage Pour Amarrage Structures Atomiques En Basse Résolution Cartes: Application à La Cryo-microscopie électronique
Cryo-microscopie électronique de particules "simples" est une méthode puissante pour analyser les structures des assemblages macromoléculaires grandes que ne se prêtent pas à une enquête par les méthodes traditionnelles cristallographie aux rayons X. Une étape clé dans ces études est d'obtenir des interprétations atomiques de complexes multiprotéiques en ajustant les structures atomiques des composants individuels dans les cartes électroniques obtenues à partir de données microscopiques. Nous rapportons ici l'utilisation d'un «noyau-pondération" méthode, combinée avec une grille-threading Monte-Carlo (GTMC) approche à cet effet. Le «noyau» d'une structure individuelle est définie pour représenter la partie où la distribution de densité est moins susceptible d'être modifié par d'autres composants qui composent l'assemblée macromoléculaire d'intérêt. La performance de la méthode a été évaluée par sa capacité à déterminer l'ajustement correct de (i) la chaîne alpha du domaine récepteur des cellules T variable dans une carte simulée du complexe alphabeta à des résolutions comprises entre 5 et 40 A, et ( ii) le domaine catalytique de l'E2 de la pyruvate déshydrogénase dans une carte déterminée expérimentalement, à 14 Une résolution du complexe de icosaédrique formée par 60 exemplaires de cette enzyme. En utilisant les structures aux rayons X des deux cas de test en tant que références, nous démontrons que, contrairement aux méthodes plus traditionnelles, la combinaison de la méthode de base de pondération et de la grille-threading Monte Carlo approche permet d'identifier le positionnement correct de manière fiable et rapide à partir de les cartes à faible résolution qui sont typiques des structures déterminés à l'aide d'une particule microscopie électronique.
Acquisition D'image Et Le Traitement Automatisé Utilisant Une Nouvelle Génération De Caméras 4K X CCD 4K Pour Les études D'électrons Cryo Microscopiques Des Assemblées Macromoléculaires
Nous avons déjà signalé le développement d'AutoEM, un logiciel pour les semi-automatisés d'acquisition de données à partir d'un microscope électronique à transmission. Dans la poursuite des efforts pour améliorer la vitesse de détermination de la structure des assemblages macromoléculaires par microscopie électronique, nous rapportons ici sur la performance d'une nouvelle génération de 4 caméras CCD K pour une utilisation dans des applications électroniques cryo microscopiques. On démontrer que à 120 kV, et à un grossissement nominale de 67000 x, des spectres de puissance et de signal sur bruit pour la caméra CCD nouvelle 4 K sont comparables aux valeurs obtenues pour les images de film numérisée avec un scanner à résolutions Zeiss aussi élevée que environ 1/6.5A (-1). La surface de l'éprouvette pour chaque exposition imagée sur le capteur CCD 4 K est d'environ un tiers de la superficie qui peut être enregistré avec une exposition similaire sur le film. La caméra CCD sert également à de l'enregistrement d'images à faible grossissement du centre du trou pour mesurer l'épaisseur de la glace vitrifiés dans le trou. La performance de l'appareil photo est satisfaisante dans les conditions de faibles doses utilisées en cryo microscopie électronique, comme démontré ici par la détermination d'une carte en trois dimensions à 15 A pour le noyau catalytique du Bacillus stearothermophilus 1,8 MDa icosaédrique complexe pyruvate déshydrogénase, et sa comparaison avec le modèle indiqué précédemment atomique pour ce complexe obtenue par cristallographie aux rayons X.
Visualisation De L'Alpha-hélicoïdales, Rassemblées Dans Un Densité Carte Produite Avec 9 Images Moléculaires De La Base MDa 1,8 Icosaédrique De La Pyruvate Déshydrogénase
Les stratégies visant à atteindre les plus hautes résolutions dans les structures de complexes protéiques déterminées par cryo-microscopie électronique impliquent généralement des informations à partir de la moyenne un grand nombre de particuliers images moléculaires. Toutefois, des limites importantes sont posées par l'hétérogénéité de la qualité de l'image et dans la conformation des protéines qui sont inhérentes aux grands ensembles de données d'images. Ici, nous démontrons que la combinaison de raffinement itératif et rigoureux tri moléculaire est une méthode efficace pour obtenir des améliorations substantielles dans la qualité de la carte de l'1,8 MDa noyau catalytique icosaédrique du complexe pyruvate déshydrogénase de Bacillus stearothermophilus. À partir d'un ensemble de départ de 42,945 images de l'ensemble de base, on montre que en utilisant uniquement les meilleures 139 particules dans l'ensemble de données produit une carte qui est supérieure à celles qui sont construites avec un plus grand nombre d'images, et que l'emplacement d'un grand nombre de l'alpha- hélices dans la structure peut être clairement visualisée sur une carte construite à partir aussi peu que 9 particules.
Structure Moléculaire D'un 9-MDa Sous-complexe Pyruvate Déshydrogénase Icosaédrique Contenant Les Enzymes E2 Et E3 En Utilisant La Microscopie Cryoélectronique
Les complexes pyruvate déshydrogénase multienzymatiques sont parmi les plus grandes machines multifonctionnelles catalytiques dans les cellules, catalyser la production de l'acétyl-CoA à partir du pyruvate. Nous avons précédemment rapporté l'architecture moléculaire d'un sous-complexe de 11 MDa comprenant l'dihydrolipoyl 60-mère icosaédrique acétyltransférase (E2) décoré avec 60 copies de la hétérotétramérique (alpha (2) beta (2)) pyruvate décarboxylase 153-kDa (E1) à partir de Bacillus stearothermophilus (Milne, JLS, Shi, D., Rosenthal, PB, Sunshine, JS, Domingo, GJ, Wu, X., Brooks, BR, Perham, RN, Henderson, R., et Subramaniam, S. (2002) EMBO J. 21, 5587-5598). Un espace annulaire d'environ 90 A sépare les domaines catalytiques de l'acétyltransférase E2 à partir d'une coque extérieure formée de tétramères E1. Utilisation de cryomicroscopie électronique, nous présentons ici une reconstruction en trois dimensions du noyau E2 décoré avec 60 exemplaires de l'homodimère déshydrogénase dihydrolipoyl 100 kDa (E3). Le complexe E2E3 présente une fente annulaire semblable d'environ 75 A entre l'ensemble intérieur de domaines icosaédrique acétyltransférase et la coque extérieure de homodimères E3. Raccord automatisé des coordonnées dans le plan E3 indique la correspondance entre une excellente la densité de la coque extérieure et la carte des positions des deux orientations de montage supérieur de l'E3. Que dans le cas d'E1 dans le complexe E1E2, l'centrale 2 fois l'axe de l'homodimère E3 est à peu près orientée le long de la périphérie de la coque, faisant les sites actifs de l'enzyme accessible depuis la fente annulaire entre le noyau et l'enveloppe extérieure E2 coquille. Les similitudes dans l'architecture des E1E2 et E2E3 complexes indiquent des similitudes fondamentales dans le mécanisme de site actif de couplage impliqués dans les deux étapes clés qui nécessitent mouvement de balancement du domaine lipoyle à travers l'espace annulaire, à savoir la synthèse de l'acétyl-CoA et la régénération de l'anneau dithiolane du domaine lipoyle.
L'imagerie Tridimensionnelle De L'architecture Hautement Bent De Bacteriovorus Bdellovibrio à L'aide De Microscopie Cryo-électronique
Bdellovibrio cellules bacteriovorus sont de petites cellules qui se nourrissent sur deltaproteobacterial autres bactéries gram-négatives, y compris les agents pathogènes humains. Utilisation de la tomographie cryo-électronique, nous avons démontré que les cellules de B. bacteriovorus sont capables de flexibilité substantielle et de la déformation locale des membranes externes et internes sans perte de l'intégrité cellulaire. Ces changements de forme peuvent se produire dans moins de 2 min, et l'analyse de l'architecture interne de cellules hautement tordues ont montré que la répartition globale des machines moléculaires et le nucléoïde est similaire à celle dans les cellules modérément coudés. B. cellules bacteriovorus semblent contenir un vaste réseau interne de courte et de longue structures filamenteuses. Nous proposons que les réarrangements de ces structures, en combinaison avec les propriétés uniques de l'enveloppe cellulaire, peut sous-tendre la remarquable capacité des cellules B. bacteriovorus de trouver et de saisir des proies bactériennes.
Evaluation Des Algorithmes De Débruitage Pour La Tomographie électronique Biologique
Tomographies de spécimens biologiques prélevés en utilisant la microscopie électronique à transmission peut être intrinsèquement bruyante à cause de l'utilisation de doses d'électrons de faible, la présence d'un "coin manquant" dans la plupart des systèmes de collecte de données et des inexactitudes résultant lors de la reconstruction du volume 3D. Avant tomographies peut être interprété de manière fiable, par exemple, par la segmentation 3D, il est essentiel que les données soient convenablement débruiter en utilisant des procédures qui peuvent être optimisés individuellement pour les ensembles de données spécifiques. Ici, nous mettons en œuvre une procédure systématique pour comparer différentes techniques de débruitage non linéaires sur des tomographies enregistrés à température ambiante et à des températures cryogéniques, et d'établir des critères quantitatifs de choisir une approche de débruitage qui est le plus pertinent pour un tomogramme donnée. Nous démontrons que l'aide d'un algorithme de débruitage appropriée facilite la segmentation robuste de tomographies du VIH-macrophages infectés et les bactéries Bdellovibrio obtenus à partir d'échantillons à température ambiante et des températures cryogéniques, respectivement. Nous validons cette stratégie de segmentation automatique des tomographies de façon optimale débruitées en comparant ses performances à l'extraction manuelle des principales caractéristiques des tomographies mêmes.
Architecture Des Molécules D'autochtones VIH-1 Gp120 Trimères
Les glycoprotéines d'enveloppe (env) de l'homme et simien virus de l'immunodéficience (VIH et SIV, respectivement) médiation virus de liaison à CD4 de surface cellulaire sur des cellules cibles récepteurs pour déclencher l'infection. Env est un hétérodimère d'une glycoprotéine transmembranaire (gp41) et une glycoprotéine de surface (gp120), et forme trimères sur la surface de la membrane virale. Utilisation de la tomographie cryo-électronique combiné avec la classification d'images en trois dimensions et de la moyenne, nous présentons les structures tridimensionnelles de trimérique Env affiché sur natif du VIH-1 dans l'état sans ligand, dans un complexe avec les anticorps neutralisants à large spectre b12 et dans un complexe ternaire avec CD4 et l'anticorps 17b. En ajustant les structures cristallines connues de la gp120 monomérique de base dans les conformations b12 et CD4/17b-bound dans les cartes de densité obtenues par tomographie électronique, nous tirons des modèles moléculaires pour le natif du VIH-1 gp120 trimère dans les Etats sans ligand et CD4 lié . Nous démontrons que CD4 liaison entraîne une réorganisation majeure du trimère Env, provoquant une rotation vers l'extérieur et le déplacement de chaque monomère gp120. Ce semble être couplé avec un réarrangement de la région gp41 selon l'axe central du trimère, conduisant à un contact étroit entre les membranes cellulaires et viraux cible. Nos résultats élucider les changements de structure et de conformation de trimérique gp120 du VIH-1 pertinents pour la neutralisation des anticorps et l'attachement aux cellules cibles.
Architectures Moléculaires De Trimère SIV Et Glycoprotéines D'enveloppe Du VIH-1 Sur Les Virus Intacts: La Souche-dépendante Variation De La Structure Quaternaire
L'étape initiale de l'infection des cellules cibles par les activités humaines, et les simiens étroitement liées virus de l'immunodéficience (VIH et SIV, respectivement) se produit avec la liaison de glycoprotéines d'enveloppe trimériques (Env), composée d'hétérodimères de la glycoprotéine transmembranaire virale (gp41) et la glycoprotéine de surface (gp120) pour cibler des cellules T. La connaissance de la structure moléculaire de trimérique Env sur les virus intactes est important tant pour la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents interactions virus-cellules et pour la conception de efficaces immunogène des vaccins à base de lutte contre le VIH / SIDA. Les analyses précédentes de intactes virions VIH-1 Bal ont déjà abouti à des structures de trimérique Env dans les Etats sans ligand et CD4-ligandé à ~ 20 Å de résolution. Ici, nous montrons que les architectures moléculaires de trimérique Env de SIVmneE11S, SIVmac239 et le VIH-1 souches R3A sont étroitement comparable à celle déterminée au préalable pour le VIH-1 Bal, avec la variable V1 et V2 boucles situé à l'apex de la pointe, à proximité à la zone de contact entre le virus et des cellules. L'emplacement des V1/V2 boucles dans trimérique Env a été définitivement confirmé par l'analyse structurale des virions VIH-1 R3A modifiées pour exprimer Env avec la suppression de ces boucles. Il est frappant, dans SIV CP-MAC, une souche CD4-indépendante, trimérique Env est dans un constitutivement conformation «ouverte» avec la gp120 trimères évasées dans une conformation similaire à celle observée pour le VIH-1 Env BaL quand il est complexé avec sCD4 et le 17b anticorps CD4i. Nos résultats suggèrent une explication structurelle pour le mécanisme moléculaire de CD4-indépendante l'entrée du virus et en outre établir que microscopie cryo-électronique peut être utilisée pour découvrir distinctes et fonctionnellement pertinents structures quaternaires de Env affichées sur les virus intacts.
Densité Latérale De Tableaux Des Récepteurs Dans Le Plan De La Membrane Influences Sensibilité De La Réponse E. Coli Chimiotactisme
Chez les bactéries chimiotactiques, chémorécepteurs transmembranaires, Chea et Chew former le complexe de signalisation de base de l'appareil chimiotactisme sensorielle. Ces complexes sont organisés en réseaux étendus dans la membrane cytoplasmique qui permettent aux bactéries de s'adapter à l'évolution de la concentration de ligands extracellulaires via une coopérative, la réponse allostérique qui conduit à l'amplification importante du signal induit par la liaison du ligand. Ici, nous avons combiné cryo-électronique des études tomographiques de l'architecture 3D spatiale des tableaux chémorécepteurs dans intactes les cellules de E. coli avec la modélisation informatique pour développer un modèle prédictif pour la coopérativité et la sensibilité de la réponse chimiotactisme. Les prédictions ont été testées expérimentalement à l'aide Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie. Nos résultats démontrent que les changements dans la densité d'emballage latérales de la partie a ordonné, tableaux chémorécepteurs spatialement étendus peuvent moduler la réponse chimiotaxie bactérienne, et que des informations sur l'organisation moléculaire des tableaux réalisés par microscopie cryo-électronique des cellules intactes peuvent être traduits en testables, prédictives des modèles informatiques de la réponse chimiotactisme.
Trimères VIH-1 Glycoprotéine Gp140 Immunogènes Et Autochtones Glycoprotéines D'enveloppe Du VIH-1 Afficher La Même Fermés Et Ouverts Quaternaires Architectures Moléculaires
L'étape initiale de l'infection à VIH-1 se produit avec la liaison de CD4 de la surface cellulaire à trimères glycoprotéines de HIV-1 d'enveloppe (ENV), un hétérodimère d'une glycoprotéine transmembranaire (gp41) et une glycoprotéine de surface (gp120). La conception des versions solubles de trimérique Env qui affichent des propriétés structurales et fonctionnelles similaires à celles observées sur les virus intactes est hautement souhaitable du point de vue de la conception des immunogènes qui pourraient être efficaces que les vaccins contre le VIH / SIDA. Utilisation de la tomographie par cryoélectronique combinée avec étalement du sous-volume, nous avons analysé la structure de SOSIP GP140 trimères, qui sont fendues, les versions solubilisées de l'ectodomaine de trimérique VIH-1 Env. On montre que sans ligand gp140 trimères adopter un agencement quaternaire similaire à celle affichée par natives trimères sans ligand sur la surface de intactes virions VIH-1. Lorsqu'il est complexé avec du CD4 soluble, Fab 17b, qui se lie à gp120 de son site de co-récepteur de chimiokine liaison, ou les deux CD4 soluble et Fab 17b, des trimères gp140 afficher une conformation ouverte dans laquelle il ya une rotation vers l'extérieur et le déplacement de chaque protomère gp120. Nous démontrons que les arrangements moléculaires de gp120 trimères dans des conformations fermées et ouvertes de la trimère soluble sont les mêmes que celles observées pour les états fermé et ouvert, respectivement, de la gp120 trimérique sur virions VIH-1 intactes Bal, établissant que les gp140 solubles trimères peut être conçu pour imiter les transitions structurelles quaternaires affichées par trimérique native Env.
Les Structures Tridimensionnelles De CD4 Soluble Assortis États De Trimères De L'immunodéficience Simienne Glycoprotéines D'enveloppe De Virus Déterminée En Utilisant Microscopie Cryo-électronique
Les trimères d'enveloppe glycoprotéine (Env) pointes affichée sur les surfaces des virus de l'immunodéficience simienne (SIV) et humaine de type virus de l'immunodéficience 1 (VIH-1) virions sont composés de trois hétérodimères des glycoprotéines virales gp120 et gp41. Bien que la liaison de la gp120 au CD4 de la surface cellulaire et un récepteur de chimiokine est connu pour induire des changements conformationnels dans la gp120 et gp41, changements dans la structure quaternaire de la trimère n'ont que récemment été élucidé. Pour le VIH-1 BaL isoler, les résultats de CD4 de fixation dans un réarrangement de frappe du trimère d'un «fermé» à une conformation «ouverte». L'effet de CD4 sur trimères SIV, cependant, n'a pas été décrite. Utilisation de la tomographie cryo-électronique, nous avons maintenant déterminé architectures moléculaires des CD4 soluble (sCD4) des états liés de trimères Env SIV pour trois souches différentes (SIVmneE11S, SIVmac239, et SIV CP-MAC). En contraste marqué avec le VIH-1 Bal, SIVmneE11S et SIVmac239 Env montré que de faibles changements conformationnels qui suivent sCD4 contraignant. En SIV CP-MAC, où trimérique Env affiche un constitutivement conformation «ouverte» similaire à celui observé pour le VIH-1 BaL Env dans l'état sCD4 complexé, nous montrons qu'il n'y a pas d'autres changements importants dans la conformation sur la liaison de l'une des sCD4 ou 7D3 anticorps. Les cartes de densité montrent également que 7D3 et 17b épitopes cibles des anticorps sur la gp120 qui sont sur les côtés opposés du site corécepteur contraignant. Ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur la diversité structurelle des SIV Env et de montrer qu'il ya souche-dépendants des variations de l'orientation de sCD4 liés à trimérique SIV Env.
Séparation De Calcul De L'hétérogénéité Conformationnelle De Microscopie Cryo-électronique Et 3D Sous-volume De Calcul De La Moyenne
Nous avons déjà utilisé la tomographie cryo-électronique combiné avec sous-volume moyenne et la classification d'obtenir des structures 3D des assemblages macromoléculaires dans les cas où une seule espèce dominante était présent, et a appliqué ces méthodes à l'analyse d'une variété de trimérique VIH-1 et SIV glycoprotéines d'enveloppe (ENV). Ici, nous étendons ces études en démontrant automatisé, itérative, manquant de coin corrigée alignement de l'image 3D et les méthodes de classification pour distinguer plusieurs conformations qui sont présents simultanément. Nous présentons une méthode pour mesurer la distribution spatiale des éléments vectoriels représentant distinctes états conformationnels de Env. Nous identifions le traitement des données des stratégies qui permettent une séparation claire des conformations déjà caractérisés fermées et ouvertes, ainsi que les Etats sans ligand et l'anticorps-ligandé de Env quand ils sont présents dans les mélanges. Nous montrons que l'identification et à éliminer des crêtes avec les plus faibles du signal sur bruit améliore la précision globale de l'alignement entre les différents sous-Env volumes, et que la précision d'alignement, à son tour, détermine le succès de la classification d'images dans l'évaluation de l'hétérogénéité conformationnelle dans des mélanges hétérogènes . On valider ces procédures de séparation de calcul par succès de séparation et la reconstruction des structures distinctes 3D pour conformations sans ligand et un anticorps-ligandé et ouverte et fermée de Env présents simultanément dans des mélanges.
