ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Summary

نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.

Abstract

منذ فترة طويلة الزرد تستخدم لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية في التنمية من خلال الوقت الفاصل بين التصوير من الجنين شفافة المعيشة. نحن هنا وصف الأسلوب لجبل الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير وشرح كيفية أتمتة القبض على الوقت الفاصل بين الصور باستخدام المجهر مبائر. نحن تصف أيضا طريقة لخلق رقابة ، والضرر دقيقة لفروع الفردية المحاوير الحسي المحيطي في الزرد باستخدام القوة مركزة ليزر الفيمتو ثانية شنت على مجهر ثنائي الفوتون. يجب أن يكون الأمثل للمعلمات axotomy اثنين الفوتون ناجحة لكل المجهر. وسوف نظهر اثنين الفوتون axotomy على كل مجهر ثنائي الفوتون مخصص بنيت و510 زايس / مبائر ثنائي الفوتون لتقديم مثالين.

يمكن أن الخلايا العصبية الحسية الزرد تصور ثلاثي التوائم في GFP خط المعدلة وراثيا معربا عن يقودها المروج الخلايا العصبية الحسية محددة ^1. لقد تكيفنا هذا النموذج الثلاثي التوائم الزرد لمراقبة مباشرة الحسية التجدد محوار في العيش الأجنة الزرد. الأجنة تخدير tricaine مع وضعه داخل قطرة من agarose حيث يتصلب. ومختومة يجمد الأجنة داخل غرفة التصوير مليئة قارعو الأجراس (PTU) الفنيل. لقد وجدنا أن الأجنة يمكن تصويرها بشكل مستمر في هذه الغرف ل12-48 ساعة. ثم يتم التقاط صورة واحدة مبائر لتحديد الموقع المطلوب من axotomy. وتقع منطقة الفائدة على مجهر ثنائي الفوتون التصوير تحت محاور عصبية حسية منخفضة الطاقة غير المضرة. بعد التكبير على الموقع المطلوب من axotomy ، يزداد قوة وفحص واحد من تلك المنطقة التي تعرف ما يكفي لقطع محور عصبي. ثم يتم تعيين موقع متعددة الوقت الفاصل بين التصوير حتى على مبائر المجهر لمراقبة مباشرة محواري الانتعاش من الاصابة.

Protocol

الجزء 1 : تركيب الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير

1. إعداد 1 ٪ منخفضة للذوبان agarose حل التضمين. تذوب في الماء agarose DI عن طريق تسخين في الميكروويف ، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في كتلة التدفئة في 42 درجة مئوية.
2. حدد الأجنة للتصوير وإزالة chorions عن طريق سحب بلطف بعيدا المشيماء بالملقط. يمكن وضع الأجنة في حل 5 ٪ في 22-24 قارعو الأجراس PTU التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تشكيل الصباغ. هذا يحسن من وضوح التصوير ، كما أنها ضرورية لأداء ثنائي الفوتون axotomies من محاور عصبية حسية. إذا سمح الصباغ الطبيعي للنموذج ، يحجب تألق ذاتي المحاوير على المجهر ثنائي الفوتون. قارعو الأجراس حل لالزرد تحتوي على 116 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.9 ملي بوكل ، 1.8 ملي CaCl ₂ ، وHEPES 5mm ، و 7،2 درجة الحموضة.
3. تخدير الأجنة عن طريق إضافة ~ tricaine 0.02 ٪ لقارعو الأجراس PTU. جعل متأكد من الحيوانات لا تستجيب للمس قبل المتابعة.
4. إعداد غرفة التصوير على المدى الطويل من خلال تطبيق الشحوم فراغ إلى جانب واحد من عصابة الزجاج أو التيفلون وتحديد وضعها على زجاج انزلاق الغطاء.
5. نقل جنين واحد الى حل agarose 42 درجة مع الماصة الزجاج ، مع الحرص على عدم نقل الكثير من PTU قارعو الأجراس ، ثم نقل الجنين مع قطرة واحدة من agarose على زلة تغطية المعدة.
6. الموقف المطلوب الجنين مثل agarose يصلب. نضع في اعتبارنا أن غرفة التصوير انقلبت عند الانتهاء بحيث سيتم تغطية زلة السطح العلوي.
7. إذا كان لديك مرحلة الآلية ويمكن أماكن متعددة في صورة واحدة ، كرر الخطوات من 1،4-1،6 لكل الجنين.
8. السماح لترسيخ agarose تماما ، ثم ملء الحلبة مع 0.02 ٪ قارعو الأجراس PTU tricaine.
9. تطبيق الشحوم فراغ إلى الجانب الآخر من الحلبة (ق) ، ثم تغطية الحلقة (s) مع شريحة زجاجية. الوجه غرفة مغلقة (ق) انتهى. ويمكن استخدام هذه الغرف للتصوير على المجاهر رأسي أو مقلوب.

الجزء 2 : اثنان الفوتون axotomy به العرف بنيت اثنين الفوتون المجهر مع ليزر الياقوت TI - الحرباء

1. الاستعداد للتصوير. وضع الجنين محمولة (ق) على حامل الشرائح تحت المجهر. التركيز على جنين واحد لتحقيق هدف المياه 40X (0.8 NA). بدوره على الليزر. كنا قادرين على تصور والضرر بتكاثر GFP معربا عن الخلايا العصبية باستخدام المعلمات التالية. لتصور المحاوير في السلطة غير الضارة ، وتعيين ليزر لطول موجة من 910 نانومتر (نانومتر) ، وقوة من 30 الميللي واط (MW المذكورة هي كمية الطاقة في العينة). افتح البرنامج التصوير. نحن نستخدم برامج ScanImage المتقدمة في مختبر كاريل سفوبودا في ^{2 و 3.}
2. اضغط على التركيز على فحص الجنين مع ليزر ثنائي الفوتون ، موقع محوار كنت ترغب في axotomize ، والتقاط صورة من هذا المحور. علامة المواقف الأول والأخير Z ، والحصول على الصورة ، وجعل الحد الأقصى لإسقاط مداخن Z.
3. تكبير 70X على فرع من محوار كنت ترغب في وقف axotomize والمسح الضوئي. زيادة ميغاواط في العينة إلى قوة مدمرة من 180 ميغاواط ، وإجراء فحص واحد مع الليزر. ونحن نفعل ذلك عن طريق تعيين عدد من شرائح الألف إلى الياء (1) والضغط على "انتزاع". ينبغي أن يكون هذا كافيا لقطع المحور. انظر المناقشة عن طرق لتحسين هذا الإجراء المجهر الخاص والهدف التجريبية.
4. التصغير ، والحد من الطاقة الى 30 ميغاواط ، والتقاط صورة.

الجزء 3 : اثنان الفوتون axotomy على زايس مجهر 510 مبائر / اثنين الفوتون

1. شنت مكان الجنين على خشبة المسرح وجعله هدفا التركيز باستخدام المياه 25X أو موضوعية أخرى مناسبة.
2. بدوره على اثنين والفوتون (910 نانومتر) والأرجون (488 نانومتر) ليزر في محيط متعدد المسارات بحيث أنه من الممكن أن تتحول من واحدة إلى أخرى. على الرغم من أن تستخدم على حد سواء ليزر للكشف عن GFP ، انبعاث ثنائي الفوتون هو تصور مع الأحمر ، وانبعاث الليزر الاخضر مع الأرجون للتمييز بين البلدين.
3. استخدام ليزر الأرجون لتحديد محور عصبي إلى إصابة. تحت إعدادات علامة Z المقاطع الأولى والأخيرة البصرية. التقاط صورة مبائر وخلق الحد الأقصى من الإسقاط المكدس Z.
4. اختيار منطقة لتكون محور عصبي الجرحى وتقديم هذه المنطقة في التركيز. إيقاف ليزر الأرجون وتشغيل ليزر ثنائي الفوتون. فحص العينة مع الفوتون اثنين في كثافة الليزر انتقال ~ 9 ٪ للتأكد من أن محور عصبي لا يزال في التركيز.
5. انقر على "وقف" الزر بحيث أداة المحاصيل ستكون متاحة. استخدام المحاصيل لزوم في مجال الاهتمام. نحن عادة لتقريب 70X ~ (يمكن التحقق من التكبير تحت علامة التبويب "واسطة"). تحت علامة التبويب "قنوات" تغيير شدة الفوتون اثنين من انتقال ~ 9 ٪ لنقل 15-20 ٪.
6. قطع محور عصبي تنشيط السريع "XY" الزر لحوالي 1 ثانية ، ثم اضغط على زر التوقف لتجنب الأضرار الزائدة. ينبغي أن ينظر إليه كما محوار الحطام المتناثرة إذا كان الإجراء يعمل.
7. لضمان أن تكون محور عصبيولحقت أضرار التبديل إلى ليزر الأرجون 488 نانومتر ، والتقاط صورة أخرى مبائر ، وخلق توقعات الحد الأقصى.

الجزء 4 : متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير على زايس LSM 510

1. الاستعداد للتصوير. إذا كنت تستخدم مرحلة ساخنة ، تأكد من تشغيله 30 دقيقة على الأقل قبل إعداد وقتك مرور الفيلم. وضع الجنين محمولة (ق) على حامل الشرائح تحت المجهر. التركيز على جنين واحد مع الهدف المنشود الهواء. نستخدم 20X وموضوعية NA 0.5. فتح زايس التصوير 510 LSM البرمجيات. بدوره على الليزر المناسب وإعداد التكوين المطلوب. الآن سنقوم بشرح مفصل لبروتوكول التصوير طويلة الأمد مع LSM زايس البرامج الزمنية المتعددة. ويمكن تكييف هذه الطرق للاستخدام على المجهر الخاصة بك مع برامج التصوير الخاصة بك.
2. تحديد موقف وتكوين الجنين الأولى في إطار موضوع التوقيت. فتح الفحص ، مرحلة ، ونوافذ متعددة من الزمن. تنشيط سريع الفحص على نافذة المسح الضوئي. الانتقال إلى مرحلة موقف XY المطلوب. علامة المواقف الأول والأخير Z في إطار الفحص. اضغط على التوقف ، ثم متوسط ​​، وأيضا في إطار الفحص. انتظر تفحص الشريحة Z المتوسطة وحتى النهاية ، ثم اضغط علامة الموقف في إطار المرحلة. إذا كنت واحدة فقط التصوير الجنين ، انقر على "واحدة الموقع" التبويب في إطار موضوع التوقيت. انقر على "XYZ يستعاض عن عبارة" ثم على "حفظ التكوين". توافق عندما طلب منه الكتابة التكوين السابق. انتقل إلى الخطوة 4.4. إذا كان لديك مرحلة ميكانيكية ، يمكنك إعداد مواقع متعددة لصورة الأجنة المتعددة. في هذه الحالة ، يجب تحديد "مواقع متعددة" التبويب قبل تحديد XYZ والتكوين لموقعك الأول. أيضا ، تأكد من أن القائمة المنسدلة أسفل "متعددة المواقع" هو علامة على الموقع 1 ، وذلك في القائمة المنسدلة في القسم التكوين يقول متعددة في الموضع 1 ، قبل النقر على حفظ التكوين.
3. تحديد موقف وتكوين الأجنة المتبقية الخاص في إطار موضوع التوقيت. تحديد الجنين الخاص بك المقبل ، ثم اضغط على مسح سريع ونقل الى مرحلة الموقف XY المطلوب ، ووضع علامة مواقفكم Z الأولى والأخيرة في إطار الفحص. اضغط على التوقف ، ثم متوسط ​​، وأيضا في إطار الفحص. انتظر تفحص الشريحة Z المتوسطة وحتى النهاية ، ثم اضغط علامة الموقف في إطار المرحلة. انقر على "XYZ استبدال". تأكد من أن القائمة المنسدلة أسفل "مواقع متعددة" علامة على الموقع 2 ، وذلك في القائمة المنسدلة في القسم التكوين المتعدد يقول الموضع 2 ، ثم انقر على "حفظ التكوين". توافق عندما طلب منه الكتابة التكوين السابق. كرر هذه العملية لأجنة المتبقية.
4. إعداد المعلمات من أجل الحصول على الصور في نافذة لوك موضوع. اختر الخيار GR - GL في المقطع "قائمة كتل" ، ثم أدخل الرقم المطلوب من التكرار المجموعة. هذا هو عدد المرات التي مبائر ستكتسب صورة في كل موقع. أدخل الفاصل الزمني المطلوب الانتظار في المقطع معلمات. هذا هو مقدار الوقت من بداية التصوير تكرار واحد لبدء تكرار المقبل. حدد "ZStackXY" في قسم التكوين. كنت أدخل قاعدة اسم الملف في الجزء السفلي. انقر على "صورة DB حدد" واختيار MDB الخاص بك. انقر على زر "خيارات". حدد المجلد الخاص MDB لحفظ الملفات المؤقتة. الاختيار "ابقاء الصورة النهائية مفتوحة" ، "حفظ الصورة النهائية" ، و "وسط كومة Z". حدد الفاصل الزمني الانتظار. انقر فوق موافق لإغلاق نافذة الخيارات. انقر على "وقت البدء". ترك موضوع نافذة مفتوحة لمدة من الزمن من التصوير.
5. تحليل البيانات الخاصة بك. عند تصوير مرور الزمن انتهى ، يقوم البرنامج من الزمن موضوع تجميع كافة الملفات المؤقتة في ملف ملخص عن كل موقع. إذا كنت ترغب في إيقاف الفيلم قبل أن يكتمل ، ومن المؤكد أن اضغط على "إنهاء" بدلا من "إيقاف" ، بحيث سيتم إنشاء ملف الموجزة. يجب أن تكون الملفات المؤقتة والملفات المحفوظة ملخص تلقائيا إلى مجلد MDB المعينة. LSM من القائمة البرامج ، انقر على "عرض 3D" ، ثم "الإسقاط". مع ملف ملخص اخترتها في القائمة المنسدلة ، انقر على "تطبيق". سوف تولد هذه التوقعات إلى أقصى حد من المكدس Z لكل صورة مبائر. LSM القائمة على البرامج ، انقر على "ملف" ، ثم "تصدير". حفظ أقصى التوقعات على شكل سلسلة من الملفات TIF. يمكنك ثم إنشاء فيلم من سلسلة من الملفات باستخدام ImageJ TIF أو Pro كويك تايم. ويمكن إرجاع المحاوير في الصور LSM في ثلاثة أبعاد الصورة باستخدام برامج التحليل (مثل NeuroLucida من MicroBrightfield) لتوليد كمية من المعلومات المفصلة حول محوار التشكل.

الجزء 5 : نتائج الممثل

وهناك تجربة ناجحة يسفر عن تمثيل دقيق لديناميكية الخلويةق الانتعاش محوار من الاصابة. وسوف يكون لديك أجنة سليمة بعد التصوير ، مع عدم وجود انحطاط مرئية ونبضات قوية. ينبغي أن يؤدي إلى تلف axotomy دقيقة ، قطع فقط فرع محدد من محور عصبي. وينبغي أن يكون هناك أي ضرر يلحق المحاور المحيطة بها ، والحد الأدنى من موت الخلية. نعتقد أننا نرى الموت من خلية واحدة البشرة مباشرة عبر موقع axotomy في 50 ٪ ~ من التجارب. إذا كنت مراقبة المزيد من الضرر ، يجب تحسين بك بروتوكول ثنائي الفوتون كما هو موضح في المناقشة.

Discussion

وقد استخدمنا الأساليب المذكورة على وجه التحديد axotomize المحاوير الحسية المحيطية ومراقبة مباشرة التجدد في الأجنة الحية الزرد. يمكن استخدامها على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير مبائر في الزرد لمراقبة العمليات التنموية كثيرة في الجسم الحي. يمكن تعديل هذا الإجراء axotomy اثنين الفوتون وصف لأهداف تجريبية كثيرة مختلفة. وقد استخدمنا نفس الإجراء عامة ليجتذ كامل الخلية العصبية الحسية الثلاثي التوائم الهيئات ، التي يركز اهتمامه على خلايا الجسم بدلا من التركيز على فرع من محور عصبي محيطي. يمكن أن يكون أي نوع من الخلايا التالفة تعريفية مع مضان بالتحديد أو ablated مع السلطة مركزة ليزر الفيمتو ثانية. استلهمت مثالية لنا هذه التقنيات لنظام الدراسات السابقة التي الزرد في العديد من النظم الأخرى التي تستخدم فيها أشعة الليزر نبضية لخلق أضرار موضعية أو إلى الخلايا يجتذ ^4،5،6. في التجارب التي تحكم اكدنا axotomy دقيق للغاية : لدينا أبدا التالفة المحاور القريبة ، حتى عندما تكون فرعا من نفس الخلية ، وأحيانا فقط بأضرار الخلايا الظهارية في تجاور قريبة من المحاور. ويمكن تفسير هذه الخصوصية من حقيقة ان اثنين من شدة الإثارة الليزر الفوتون يسقط quadratically مع المسافة من نقطة محورية ^3،7. علاوة على ذلك ، لأن الطاقة المنبعثة من fluorophore متحمس يساهم في photodamage ، غير المسماة الخلايا المحيطة من المحتمل أن تكون بمنأى.

يجوز للقوة الليزر اللازمة لمحور عصبي الضرر تختلف تبعا للإعداد ليزر ، في عمق النسيج ، وهدفك التجريبية. إذا كنت ترغب في الاضرار المحاوير أعمق في الجنين ، سوف يتطلب المزيد من الطاقة. فمن الأفضل لمحاولة axotomy في انخفاض القوة ، ومن ثم زيادة القوة تدريجيا حتى تجد المبلغ الذي سوف تقطع محور عصبي. وبمجرد الانتهاء من تحديد المبلغ المناسب للقوة الليزر لaxotomy ، يجب أن تكون قادرا على استخدام هذه السلطة بتكاثر الليزر يسبب تلف الأنسجة المحلية. إذا لاحظت أن هناك حاجة أكثر قوة بمرور الوقت لإنشاء axotomy ، قد تحتاج إلى مجهر الليزر والصيانة (على سبيل المثال ، قد يكون ليزر خارج المحاذاة). تأكد من محاذاة صحيح الليزر الخاص بك ونظيفة والهدف الخاص بك ، والتحقق من المرايا.