نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
منذ فترة طويلة الزرد تستخدم لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية في التنمية من خلال الوقت الفاصل بين التصوير من الجنين شفافة المعيشة. نحن هنا وصف الأسلوب لجبل الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير وشرح كيفية أتمتة القبض على الوقت الفاصل بين الصور باستخدام المجهر مبائر. نحن تصف أيضا طريقة لخلق رقابة ، والضرر دقيقة لفروع الفردية المحاوير الحسي المحيطي في الزرد باستخدام القوة مركزة ليزر الفيمتو ثانية شنت على مجهر ثنائي الفوتون. يجب أن يكون الأمثل للمعلمات axotomy اثنين الفوتون ناجحة لكل المجهر. وسوف نظهر اثنين الفوتون axotomy على كل مجهر ثنائي الفوتون مخصص بنيت و510 زايس / مبائر ثنائي الفوتون لتقديم مثالين.
يمكن أن الخلايا العصبية الحسية الزرد تصور ثلاثي التوائم في GFP خط المعدلة وراثيا معربا عن يقودها المروج الخلايا العصبية الحسية محددة 1. لقد تكيفنا هذا النموذج الثلاثي التوائم الزرد لمراقبة مباشرة الحسية التجدد محوار في العيش الأجنة الزرد. الأجنة تخدير tricaine مع وضعه داخل قطرة من agarose حيث يتصلب. ومختومة يجمد الأجنة داخل غرفة التصوير مليئة قارعو الأجراس (PTU) الفنيل. لقد وجدنا أن الأجنة يمكن تصويرها بشكل مستمر في هذه الغرف ل12-48 ساعة. ثم يتم التقاط صورة واحدة مبائر لتحديد الموقع المطلوب من axotomy. وتقع منطقة الفائدة على مجهر ثنائي الفوتون التصوير تحت محاور عصبية حسية منخفضة الطاقة غير المضرة. بعد التكبير على الموقع المطلوب من axotomy ، يزداد قوة وفحص واحد من تلك المنطقة التي تعرف ما يكفي لقطع محور عصبي. ثم يتم تعيين موقع متعددة الوقت الفاصل بين التصوير حتى على مبائر المجهر لمراقبة مباشرة محواري الانتعاش من الاصابة.
البروتوكول
الجزء 1 : تركيب الأجنة الزرد لمدة طويلة الأجل التصوير
- إعداد 1 ٪ منخفضة للذوبان agarose حل التضمين. تذوب في الماء agarose DI عن طريق تسخين في الميكروويف ، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في كتلة التدفئة في 42 درجة مئوية.
- حدد الأجنة للتصوير وإزالة chorions عن طريق سحب بلطف بعيدا المشيماء بالملقط. يمكن وضع الأجنة في حل 5 ٪ في 22-24 قارعو الأجراس PTU التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تشكيل الصباغ. هذا يحسن من وضوح التصوير ، كما أنها ضرورية لأداء ثنائي الفوتون axotomies من محاور عصبية حسية. إذا سمح ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمنا الأساليب المذكورة على وجه التحديد axotomize المحاوير الحسية المحيطية ومراقبة مباشرة التجدد في الأجنة الحية الزرد. يمكن استخدامها على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير مبائر في الزرد لمراقبة العمليات التنموية كثيرة في الجسم الحي. يمكن تعديل هذا الإجراء axotomy اثنين الفوتون وصف لأهداف تجريبية كثيرة مختلفة. وقد استخدمنا نفس الإجراء عامة ليجتذ كامل الخلية العصبية الحسية الثلاثي التوائم الهيئات ، التي يركز اهتمامه على خلايا الجسم بدلا من التركيز على فرع من مح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
نشكر مارك Terasaki الأولية للحصول على المشورة حول استخدام المجهر ثنائي الفوتون لخلق المحلية تلف الأنسجة ، وكاثي Joubin للحصول على المشورة بشأن تصاعد لمرور الزمن والتصوير ، ومختبرات وSagasti Portera كايلي مقابل المناقشات. وأجريت تجارب أولية مثل العشب زميل في مختبرات مؤسسة البيولوجية البحرية في وودز هول ، MA. وأيد العمل في المختبر Sagasti من المنح المقدمة من المؤسسة وايتهول ، ومؤسسة Klingenstein ، وشهادة بوروز صندوق ويلكوم جائزة في العلوم البيولوجية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المراجع
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
