Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Summary

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Abstract

Peixe-zebra tem sido utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento por lapso de tempo de imagem do embrião vivo transparente. Aqui nós descrevemos um método para montar embriões zebrafish de longo prazo de imagem e demonstrar como automatizar a captura de imagens de lapso de tempo usando um microscópio confocal. Descrevemos também um método para criar danos, controlado precisa para ramos individuais de axônios sensitivos periféricos em zebrafish usando o poder concentrado de um laser de femtosegundos montado em um microscópio de dois fotões. Os parâmetros para axotomia dois fótons de sucesso deve ser otimizada para cada microscópio. Vamos demonstrar dois fótons axotomia em ambos um costume construída microscópio de dois fótons e uma Zeiss 510 / confocal de dois fótons para fornecer dois exemplos.

Zebrafish trigeminal neurônios sensoriais podem ser visualizados em uma linha de transgênicos expressando GFP dirigido por um promotor neurônio sensorial específica ^1. Nós adaptamos este modelo zebrafish trigeminal para observar diretamente a regeneração do axônio sensorial em que vivem os embriões do zebrafish. Embriões são anestesiados com tricaina e posicionado dentro de uma gota de agarose como ela se solidifica. Embriões imobilizado são selados dentro de uma câmara de imagem cheia de phenylthiourea (PTU) Ringers. Nós descobrimos que os embriões podem ser continuamente trabalhada, nas câmaras de 12-48 horas. A única imagem confocal é então capturado para determinar o local desejado para a axotomia. A região de interesse está localizado no microscópio de dois fotões por imagem os axônios sensoriais em baixa, o poder não-prejudicial. Depois de ampliar no local desejado de axotomia, a potência é aumentada e uma única varredura da região definida é suficiente para romper o axônio. Múltiplas localização de imagens de lapso de tempo é então configurado em um microscópio confocal para observar diretamente a recuperação de uma lesão axonal.

Protocol

Parte 1: embriões zebrafish de montagem para longo prazo imagem

1. Prepare 1% agarose baixo derreta solução para a incorporação. Dissolver a agarose em água DI por aquecimento em um forno de microondas, alíquota em pequenos tubos e armazenar em um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius.
2. Selecionar embriões para geração de imagens e remover seus córions puxando o córion distante com fórceps. Embriões podem ser colocados em uma solução de 5% Ringers PTU em 22-24 horas após a fertilização (hpf) para inibir a formação de pigmento. Isso melhora a clareza de imagem e é essencial para a realização de dois fótons axotomies dos axônios sensitivos. Se o pigmento natural é permitida a forma, obscurece autofluorescência axônios no microscópio de dois fotões. Ringers solução para zebrafish contém 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, e HEPES 5mM, pH 7,2.
3. Anestesiar embriões adicionando ~ tricaina 0,02% ao Ringers PTU. Fazer animais com certeza não são sensíveis a toque antes de prosseguir.
4. Prepare a câmara de imagem a longo prazo através da aplicação de graxa de vácuo para um dos lados de um anel de vidro ou teflon e fixá-la em uma lamínula de vidro.
5. Transferência de um embrião para a solução de agarose 42 graus com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não transferir a maior parte do Ringers PTU, em seguida, transferir o embrião com uma gota de agarose para uma lamínula preparado.
6. Posição do embrião como desejado como a agarose endurece. Tenha em mente que a câmara de imagem será invertido quando você está feito para que a lamínula será a superfície superior.
7. Se você tem um estágio motorizado e pode locais de várias imagens de uma vez, repita os passos de 1,4-1,6 para cada embrião.
8. Permitir que a agarose completamente solidificar, em seguida, preencher o anel com 0,02% tricaina PTU Ringers.
9. Aplique graxa de vácuo para o outro lado do ringue (s), em seguida, cobrir o anel (s) com uma lâmina de vidro. Virar a câmara selada (s) mais. Estas câmaras podem ser usados ​​para geração de imagens em microscópios vertical ou invertida.

Parte 2: Dois fótons axotomia usando um personalizado construído microscópio de dois fótons com um Ti-Safira Chameleon a laser

1. Prepare-se para imagens. Coloque o embrião montado (s) em um compartimento de slides, sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com o objectivo de água 40X (0.8 NA). Ligue o laser. Temos sido capazes de visualizar e reproduzível danos GFP expressar neurônios utilizando os seguintes parâmetros. Para visualizar os axônios de um poder não-prejudiciais, definir a laser para um comprimento de onda de 910 nanômetros (nm) e uma potência de 30 miliwatts (mW listados são a quantidade de energia na amostra). Abra o software de imagem. Nós usamos Software scanimage desenvolvido em laboratório Karel Svoboda ^{2, 3.}
2. Pressione o foco para a varredura do embrião com o laser de dois fótons, localize o axônio que deseja axotomize, e capturar uma imagem do axônio. Marcar a primeira ea última posições Z, adquirir a imagem, e fazer uma projeção máxima das pilhas Z.
3. Zoom em 70X no ramo do axônio que deseja axotomize e interromper a digitalização. Aumentar o mW na amostra para o poder de causar dano de 180 mW, e realizar um único exame com o laser. Fazemos isso definindo o número de fatias Z a 1 e pressionando "Grab". Isso deve ser suficiente para romper o axônio. Veja a discussão de métodos para otimizar este procedimento para o seu microscópio e objetivo experimental.
4. Diminuir o zoom, reduzir o poder de 30 mW e ter uma imagem.

Parte 3: Two-photon axotomia em microscópio confocal Zeiss 510 / dois fótons

1. Lugar montado embrião para o palco e trazê-lo em foco utilizando objetiva de 25X de água ou objetivo adequado.
2. Ligue a dois fótons (910 nm) e argônio (488 nm) lasers em um ambiente multi-track de modo que é possível mudar de um para o outro. Embora ambos os lasers são usados ​​para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizado com o vermelho, eo argônio emissão laser com verde para diferenciar os dois.
3. Use o laser de argônio para identificar um axônio para ferir. Sob Z configurações marcar a primeira ea última seções ópticas. Pegue uma imagem confocal e criar uma projeção máxima da pilha Z.
4. Escolha a região do axônio de ser ferido e trazer esta região em foco. Desligue o laser de argônio e ligue o laser de dois fótons. Varredura da amostra com os dois fótons de laser em uma intensidade de aproximadamente 9% de transmissão para se certificar de que o axônio ainda está em foco.
5. Clique no botão "stop" para que a ferramenta de corte estarão disponíveis. Use cultura para ampliar a área de interesse. Geralmente nós zoom para ~ 70X (zoom pode ser verificada com o "modo" tab). Sob a "canais" guia alterar a intensidade dos dois fótons de transmissão ~ 9% para a transmissão de 15-20%.
6. Para cortar um axônio ativar o "fast XY" botão por cerca de 1 segundo e pressione o botão Parar para evitar danos em excesso. O axônio deve ser visto como destroços espalhados se o procedimento funcionou.
7. Para garantir que o axôniofoi danificado voltar para a 488 nm laser de argônio, tomar outra imagem confocal, e criar uma projeção máxima.

Parte 4: imagens de lapso de tempo em Confocal Zeiss LSM 510

1. Prepare-se para imagens. Se você estiver usando uma fase aquecida, certifique-se de transformá-lo em pelo menos 30 minutos antes de montar seu filme de lapso de tempo. Coloque o embrião montado (s) em um compartimento de slides, sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com o objectivo de ar desejado. Nós usamos um 20X, 0,5 objetivo NA. Abra Zeiss LSM 510 software de imagem. Ligue a lasers adequadas e criar a configuração desejada. Vamos agora descrever um protocolo detalhado para a imagem a longo prazo com software Zeiss LSM Tempo Multi. Estes métodos podem ser adaptados para uso em seu próprio microscópio com o seu software de imagem.
2. Definir a posição e configuração do seu primeiro embrião na janela Tempo Multi. Abra o scan, palco, e as janelas Tempo Multi. Ativar rápida varredura na janela de digitalização. Mover o palco para a posição desejada XY. Marcar a primeira ea última posições Z na janela de digitalização. Pressione parar, então Mid, também na janela de digitalização. Aguarde o scan da fatia Z meio para terminar, pressione posição da marca na janela palco. Se você é apenas um embrião de imagens, clique no "Single Location" tab na janela Tempo Multi. Clique em "Replace XYZ" e depois em "Save Configuration". Concordo quando solicitado a substituir a configuração anterior. Avance para o passo 4.4. Se você tem um estágio mecanizada, você pode configurar vários locais para embriões de várias imagens. Neste caso, você deve selecionar o "Multiple Locations" guia antes de definir o XYZ e configuração para a sua localização em primeiro lugar. Além disso, certifique-se que o menu pull-down logo abaixo da "Multiple Locations" guia é sobre a localização 1, e que o menu suspenso na seção de configuração diz vários loc 1, antes de clicar em salvar a configuração.
3. Definir a posição e configuração de seus embriões restantes na janela Tempo Multi. Localize o seu embrião que vem, em seguida, pressione scan rápido, mova o estágio na posição XY desejado e marcar a sua primeira e última posições Z na janela de digitalização. Pressione parar, então Mid, também na janela de digitalização. Aguarde o scan da fatia Z meio para terminar, pressione posição da marca na janela palco. Clique em "Replace XYZ". Verifique se o menu pull-down logo abaixo da "Multiple Locations" guia é sobre a localização 2, e que o menu suspenso na seção de configuração diz loc múltiplos 2, em seguida, clique em "Save Configuration". Concordo quando solicitado a substituir a configuração anterior. Repita esse processo para os embriões restantes.
4. Configurar os parâmetros para aquisição de imagem na janela do Multi-Loc. Escolha a opção GL-GR na "Lista de Blocos" seção, em seguida, digite o número desejado de repetições grupo. Este é o número de vezes que o confocal irá adquirir uma imagem em cada local. Digite o intervalo de espera desejado na seção Parâmetros. Esta é a quantidade de tempo desde o início de uma repetição de imagens para o início da próxima repetição. Selecione "ZStackXY" na seção de configuração. Digite o nome do arquivo de base na seção inferior. Clique em "DB Selecionar Imagem" e escolha o seu mdb. Clique no botão "Opções". Selecione a pasta para salvar arquivos mdb temp. Marque a opção "manter a imagem final aberta", "salvar imagem final", e "meio da pilha z". Selecione esperar intervalo. Clique em OK para fechar a janela de opções. Clique em "hora de início". Deixe a janela aberta multi Tempo de duração das imagens.
5. Analisar seus dados. Quando a imagem de lapso de tempo tenha terminado, o software multi Tempo irá compilar todos os seus arquivos temporários em um arquivo de resumo para cada local. Se você quiser parar o filme antes de ser concluída, não se esqueça de pressionar "Finish" em vez de "Stop", de modo que um arquivo de resumo será criado. Os arquivos temporários e arquivos de resumo deve ser automaticamente salvo na pasta mdb designado. No menu software LSM, clique em "Ver 3D", então "Projecção". Com o seu arquivo de resumo selecionado no menu suspenso, clique em "Apply". Isso irá gerar projeções máxima da pilha de Z para cada imagem confocal. No menu software LSM, clique em "Arquivo", depois em "Export". Salve o máximo projeções como uma série de arquivos tif. Você pode então criar um filme fora da série de tif usando ImageJ ou QuickTime Pro. Axônios nas imagens LSM pode ser rastreada em três dimensões usando software de análise de imagem (por exemplo, NeuroLucida de MicroBrightfield) para gerar informações quantitativas detalhadas sobre a morfologia do axônio.

Parte 5: Os resultados representativos

A experiência bem sucedida irá resultar em uma representação precisa da dinâmica celulars de axônio recuperação da lesão. Seu embriões será saudável após imagem, sem degeneração visível e uma batida de coração forte. A axotomia deve resultar em danos preciso, só cortando o ramo definido do axônio. Não deve haver prejuízo para os axônios circundante e morte celular mínima. Acreditamos que vemos a morte de uma única célula epidérmica diretamente sobre o local da axotomia em ~ 50% dos experimentos. Se você observar mais dano, você deve otimizar o protocolo de dois fótons, como descrito na discussão.

Discussion

Nós temos usado os métodos descritos com precisão axotomize periféricos axônios sensitivos e observar diretamente a regeneração no embrião do zebrafish vida. Longo prazo de imagens de lapso de tempo confocal em zebrafish pode ser usado para observar muitos processos de desenvolvimento in vivo. O procedimento axotomia dois fótons descritos podem ser modificadas para muitos diferentes objetivos experimentais. Temos usado o mesmo procedimento geral para extirpar toda trigeminal corpos celulares dos neurônios sensoriais, aproximando-se sobre o corpo da célula, em vez de um ramo do axônio periférico. Qualquer tipo de célula identificável com fluorescência pode ser precisamente danificado ou ablated com o poder concentrado do laser de femtosegundos. Nós fomos inspirados para aperfeiçoar estas técnicas para o sistema de zebrafish por estudos anteriores em vários outros sistemas, onde lasers pulsados ​​foram usados ​​para criar danos localizados ou para extirpar as células ^4,5,6. Em experimentos de controle que confirmou que axotomia é extremamente preciso: nós nunca ter danificado axônios nas proximidades, mesmo quando eles são ramos de uma mesma célula, e só ocasionalmente danificado células epiteliais em justaposição perto de axônios. Esta especificidade pode ser explicada pelo fato de que a intensidade de dois fótons do laser de excitação cai quadraticamente com a distância do ponto focal ^3,7. Além disso, já que a energia emitida pelo fluoróforo animado contribui para photodamage, que envolve as células unlabeled provavelmente serão poupados.

A potência do laser necessário para danificar um axônio pode variar dependendo do conjunto até do laser, a profundidade do tecido, e seu objetivo experimental. Se você deseja axônios danos mais profundos no embrião, mais potência será necessária. O melhor é tentar a axotomia em um baixo consumo de energia, e então gradualmente aumentar o poder até encontrar o montante que irá romper o axônio. Depois de ter determinado a quantidade adequada de potência do laser para a axotomia, você deve ser capaz de usar este poder reproducibly laser para causar danos no tecido local. Se você perceber que o poder ao longo do tempo mais é necessário para criar uma axotomia, o laser e microscópio podem necessitar de manutenção (por exemplo, o laser pode estar fora do alinhamento). Verifique se o seu laser é alinhado, limpar o seu objetivo, e verificar os espelhos.