Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Abstract

Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren.

Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor ¹ angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.

Protocol

Teil 1: Montieren Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung

1. Bereiten Sie 1% niedrig schmelzende Agarose-Lösung für die Einbettung. Lösen Sie Agarose in DI-Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, Aliquot in kleine Röhrchen und lagern in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius.
2. Wählen Embryonen für die Bildgebung und entfernen ihre Chorion durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit einer Pinzette. Embryonen können in eine 5% PTU Ringers Lösung bei 22-24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) platziert werden, um die Bildung von Pigment zu hemmen. Dies verbessert die Klarheit der Bildgebung und ist essentiell für die Durchführung der Zwei-Photonen axotomies sensorischer Axone. Wenn das natürliche Pigment zu bilden erlaubt ist, verdeckt Autofluoreszenz Axone über die Zwei-Photonen-Mikroskop. Ringers Lösung für Zebrafisch enthält 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, und 5 mM HEPES, pH 7,2.
3. Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von ~ 0,02% Tricaine der PTU Ringers. Stellen Sie sicher, Tiere sind nicht ansprechbar, bevor Sie fortfahren berühren.
4. Bereiten Sie die langfristige Bildgebung Kammer durch Anlegen von Vakuum Fett auf der einen Seite einer Glas-oder Teflon-Ring und Fixieren auf ein Deckglas.
5. Transfer eines Embryos in die 42 Grad Agarose-Lösung mit einer Glaspipette, dabei nicht zu viel von der PTU Ringers zu übertragen, dann Transfer des Embryos mit einem Tropfen Agarose auf eine vorbereitete Deckglas.
6. Position der Embryo wie gewünscht als die Agarose erstarrt. Denken Sie daran, dass die Bildgebung Kammer wird umgedreht, wenn Sie fertig sind, so dass das Deckglas wird die Oberseite werden.
7. Wenn Sie einen motorisierten Tisch und Bild mehrere Standorte auf einmal, wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,6 für jeden Embryo.
8. Lassen Sie die Agarose vollständig erstarren, dann füllen Sie den Ring mit 0,02% Tricaine PTU Ringers.
9. Bewerben Vakuumfett auf die andere Seite des Rings (s), dann decken die Ring (e) mit einem Glasträger. Klappen Sie den verschlossenen Kammer (n) über. Diese Kammern können für die Bildgebung auf aufrechte oder inverse Mikroskope verwendet werden.

Teil 2: Zwei-Photonen-Axotomie mit einem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop mit einer Chameleon Ti-Saphir-Laser

1. Bereiten Sie für die Bildgebung. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit einem 40X (0,8 NA) Wasser Ziel. Schalten Sie den Laser. Wir konnten reproduzierbar zu visualisieren und zu Schäden GFP-exprimierenden Neuronen mit den folgenden Parametern. Zur Visualisierung Axone an einer nicht-schädigenden Kraft gesetzt Laser mit einer Wellenlänge von 910 Nanometern (nm) und einer Leistung von 30 Milliwatt (mW aufgeführt sind die Höhe der Leistung bei der Probe). Öffnen Sie die Imaging-Software. Wir verwenden scanimage Software in Karel Svoboda Labor ^{2, 3} entwickelt.
2. Drücken Sie den Fokus auf den Embryo mit der Zwei-Photonen-Laser-Scan, suchen Sie das Axon Sie wollen axotomize und Aufnehmen eines Bildes dieses Axon. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen, erwerben Sie das Bild, und eine maximale Projektion der Z-Stapel.
3. Zoom in 70X auf dem Ast des Axons Sie wollen axotomize und aufhören zu scannen. Erhöhen Sie die mW an der Probe, um die schädlichen Leistung von 180 mW, und führen Sie einen einzigen Scan mit dem Laser. Wir tun dies, indem die Anzahl der Z Scheiben auf 1 und drücken Sie "Grab". Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen. Siehe die Diskussion für Methoden, um diesen Vorgang für Ihr Mikroskop und experimentelle Ziel zu optimieren.
4. Zoom, verringern Sie die Leistung auf 30 mW und der Aufnahme eines Bildes.

Teil 3: Zwei-Photonen-Axotomie am Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen-Mikroskop

1. Ort montiert Embryo auf die Bühne und bringen sie in den Fokus mit einem 25X Wasser objektiven oder einem anderen geeigneten Ziel.
2. Schalten Sie die Zwei-Photonen-(910 nm) und Argon (488 nm) Laser in einem Multi-Track-Einstellung, so dass es möglich ist, von einem zum anderen wechseln. Obwohl beide Laser verwendet werden, um GFP erkennen, ist die Zwei-Photonen-Emissions visualisiert mit roten, und der Argon-Laser-Emission mit grüner, die beiden zu unterscheiden.
3. Verwenden Sie den Argon-Laser zu einem Axon zu verletzen identifizieren. Unter Z-Einstellungen markieren Sie die erste und die letzte optische Schnitte. Werfen Sie einen konfokalen Bild und schaffen eine maximale Projektion der Z-Stack.
4. Wählen Sie die Region des Axons verletzt zu sein und bringen diese Region in den Fokus. Schalten Sie den Argon-Laser und schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser. Scan der Probe mit der Zwei-Photonen in einem Laser-Intensität von ~ 9% Transmission um sicherzustellen, dass das Axon noch im Fokus ist.
5. Klicken Sie auf die "Stop"-Taste, so dass die Ernte-Tool zur Verfügung stehen. Verwenden Ernte heranzoomen auf den Bereich von Interesse. Normalerweise haben wir auf ~ 70X (Zoom kann im Rahmen der "mode"-Reiter kontrolliert werden) Zoom. Unter dem Reiter "Kanäle" ändern die Intensität der Zwei-Photonen von ~ 9% Transmission zu 15-20% Transmission.
6. Um sever ein Axon aktivieren Sie die "schnellen XY"-Taste für ca. 1 Sekunde und drücken Sie die Stopp-Taste, um überschüssige Schäden zu vermeiden. Das Axon ist als verstreute Trümmer zu sehen, wenn das Verfahren gearbeitet.
7. Um sicherzustellen, dass das Axonbeschädigt wurde wieder auf das 488 nm Argon-Laser, nehmen Sie ein anderes konfokale Abbildung, und erstellen Sie eine maximale Projektion.

Teil 4: Konfokale Zeitraffer-Imaging am Zeiss LSM 510

1. Bereiten Sie für die Bildgebung. Wenn Sie mit einem beheizten Stadium befinden, sollten Sie es auf mindestens 30 Minuten einschalten, bevor die Einrichtung Ihres Zeitraffer-Film. Setzen Sie den montierten Embryo (s) auf einem Objektträger-Halter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit den gewünschten Luft Ziel. Wir verwenden ein 20X, 0,5 NA Ziel. Öffnen Zeiss LSM 510 Imaging-Software. Schalten Sie auf den entsprechenden Laser und richten Sie die gewünschte Konfiguration. Wir beschreiben jetzt ein detailliertes Protokoll für die langfristige Bildgebung mit Zeiss LSM Multi Time Software. Diese Methoden können für die Verwendung auf Ihrem eigenen Mikroskop mit Ihrer Bildbearbeitungssoftware angepasst werden.
2. Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihrer ersten Embryo in der Multi Zeitfenster. Öffnen Sie die Scan-, Bühnen-und Multi Zeitfenster. Aktivieren schnellen Scan auf dem Scan-Fenster. Bewegen Sie die Bühne, um die gewünschte XY-Position. Markieren Sie die erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Wenn Sie nur Bildgebung ein Embryo sind, auf der "Single Location"-Tab klicken Sie in der Multi Zeitfenster. Klicken Sie auf "Ersetzen XYZ" und dann auf "Save Configuration". Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Gehen Sie auf 4,4 Schritt. Wenn Sie eine mechanisierte Bühne haben, können Sie sich mehrere Standorte zu Bild mehrere Embryonen. In diesem Fall sollten Sie die "Multiple Locations" tab vor der Festlegung der XYZ und Konfiguration für Ihren ersten Standort zu wählen. Auch immer sicherstellen, dass die Pull-Down-Menü direkt unter dem "Multiple Locations" Registerkarte auf Platz 1 ist, und dass die Pull-Down-Menü bei der Projektierung, sagt multi loc 1, bevor Sie klicken Sie auf Konfiguration speichern.
3. Definieren Sie die Position und die Konfiguration Ihres restlichen Embryonen in die Multi Zeitfenster. Suchen Sie Ihren nächsten Embryo, und drücken Sie dann schnell zu scannen, bewegen sich die Bühne in die gewünschte Position XY, und markieren Sie Ihre erste und die letzte Z-Positionen in der Scan-Fenster. Drücken Sie Stop, dann Mid, auch in das Scan-Fenster. Warten Sie, bis der Scan der Mitte Z Scheibe zu beenden, drücken Sie die markierte Position in der Bühne Fenster. Klicken Sie auf "Ersetzen XYZ". Prüfen Sie, ob das Pull-Down-Menü direkt unter dem "Mehrere Standorte" auf die Registerkarte Standort 2 ist, und dass die Pull-Down-Menü in der Konfiguration Abschnitt multi loc 2 sagt, dann klicken Sie auf "Save Configuration". Zustimmen, wenn gefragt, um die vorherige Konfiguration zu überschreiben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Embryonen.
4. Stellen Sie die Parameter für die Bildaufnahme in der Multi Loc Fenster. Wählen Sie die GR-GL-Option in der "List of Blocks" Abschnitt, und geben Sie dann die gewünschte Anzahl der Wiederholungen Gruppe. Dies ist die Anzahl, wie oft der konfokalen ein Bild an jedem Ort erwerben. Geben Sie die gewünschte Warteintervall im Abschnitt Parameter. Dies ist die Zeit, die von Anfang an von einem Imaging-Wiederholung zu Beginn der nächsten Wiederholung. Wählen Sie "ZStackXY" in der Konfiguration Abschnitt. Geben Sie Basisdateinamen im unteren Bereich. Klicken Sie auf "Bild auswählen DB" und wählen Sie Ihre mdb. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Optionen". Wählen Sie Ihre mdb Ordner temporäre Dateien zu speichern. Check "zu halten endgültige Bild öffnen", "save endgültige Bild" und "Mitte des z-Stapel". Wählen Sie warten Intervall. Klicken Sie auf OK, um die Optionen zu schließen. Klicken Sie auf "Start time". Lassen Sie Multi Zeitfenster offen für die Dauer der Bildgebung.
5. Analysieren Sie Ihre Daten. Wenn der Zeitraffer-Imaging abgeschlossen ist, wird der Multi Time Software kompilieren alle temporären Dateien in eine zusammengefasste Datei für jeden Standort. Wenn Sie den Film stoppen, bevor es beendet ist möchten, müssen Sie auf "Fertig stellen" drücken, anstatt "Stop", so dass eine Zusammenfassung erstellt werden. Die temporären Dateien und Zusammenfassung Dateien sollten automatisch an den bezeichneten mdb Ordner gespeichert werden. Von der LSM Software-Menü auf "3D View" klicken, dann "Projektion". Mit Ihrer Zusammenfassung Datei im Pulldown-Menü ausgewählt wird, auf "Apply" klicken. Dies erzeugt maximale Projektionen der Z-Stack für jeden konfokalen Bild. Auf der LSM Software-Menü auf "Datei" klicken und dann "Export". Speichern Sie die maximale Projektionen als eine Reihe von tif-Dateien. Sie können dann erstellen Sie einen Film aus der Reihe von tif-Dateien mit ImageJ oder QuickTime Pro. Axone in den LSM Bilder können in drei Dimensionen mit Bildanalyse-Software (zB Neurolucida aus MicroBrightfield), um detaillierte quantitative Informationen über Axon Morphologie erzeugen zurückverfolgt werden.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse

Ein erfolgreiches Experiment wird in eine genaue Darstellung der zellulären Dynamik Ergebniss von Axon Erholung von Verletzungen. Ihre Embryonen werden nach der Bebilderung gesund, ohne sichtbare Degeneration und eine starke Herzschlag. Die Axotomie sollte präzise Schäden führen, nur Durchtrennen des definierten Zweig der Axon. Es sollte keine Schäden am umliegenden Axonen und minimal Zelltod werden. Wir glauben, sehen wir den Tod eines einzigen Epidermiszelle direkt über die Website von Axotomie in ~ 50% der Experimente. Wenn Sie mehr Schaden zu beobachten, sollten Sie optimieren Ihre Zwei-Photonen-Protokoll wie in der Diskussion beschrieben.

Discussion

Wir haben die Methoden beschrieben, um genau axotomize peripheren sensorischen Axonen und direkt zu beobachten Regeneration im lebenden Zebrafisch-Embryos verwendet. Langfristige Zeitraffer-konfokale Bildgebung in Zebrafisch kann verwendet werden, um viele Entwicklungsprozesse in vivo zu beobachten. Die Zwei-Photonen-Axotomie beschriebene Verfahren kann für viele verschiedene experimentelle Ziele modifiziert werden. Wir haben die gleiche allgemeine Verfahren zur gesamten Trigeminus sensorischen Neurons Zellkörper abzutragen, durch Zoomen in der Zellkörper, anstatt auf einem Ast des peripheren Axon. Jeder Zelltyp identifiziert mit Fluoreszenz genau beschädigt oder abgetragen mit dem Schwerpunkt Energie des Femtosekunden-Lasers. Wir waren dazu inspiriert, diese Techniken für die Zebrafisch-System von früheren Studien in verschiedenen anderen Systemen, bei denen gepulste Laser verwendet, um lokale Schäden zu erstellen oder Zellen ^4,5,6 abzutragen waren perfekt. In Kontrollversuchen wir bestätigt, dass Axotomie äußerst präzise ist: wir haben noch nie in der Nähe Axone beschädigt, auch wenn sie Zweige derselben Zelle sind, und nur gelegentlich beschädigt Epithelzellen in enge Nebeneinander von Axonen. Diese Spezifität kann durch die Tatsache, dass die Intensität von Zwei-Photonen-Laser-Anregung abfällt quadratisch mit der Entfernung vom Brennpunkt ^3,7 erklärt werden. Da darüber hinaus Energie aus dem angeregten Fluorophor emittierte trägt dazu bei Lichtschäden sind umliegenden unmarkierte Zellen wahrscheinlich verschont bleiben.

Die Laserleistung benötigt, um ein Axon Schäden können je nach Einrichtung des Lasers, die Tiefe des Gewebes, und Ihre experimentellen Ziel variieren. Wenn Sie Axone tieferen Schäden in den Embryo wollen, wird mehr Energie benötigt werden. Am besten ist es, die Axotomie bei einem Low-Power-Versuch, und dann schrittweise die Leistung zu erhöhen, bis Sie den Betrag, der dem Axon sever finden. Sobald Sie den entsprechenden Betrag der Laserleistung für Axotomie bestimmt, sollten Sie in der Lage sein reproduzierbar Nutzung dieser Laserleistung auf lokale Gewebeschäden verursachen. Wenn Sie bemerken, dass im Laufe der Zeit mehr Leistung erforderlich ist, eine Axotomie erstellen, kann der Laser und Mikroskop erfordern Wartung (z. B. der Laser kann aus der Ausrichtung). Stellen Sie sicher, Laser richtig ausgerichtet ist, reinigen Ihr Ziel, und überprüfen Sie den Spiegeln.