Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Abstract

Le poisson zèbre ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement en imagerie time-lapse de l'embryon vivant transparente. Nous décrivons ici une méthode pour monter embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie et de démontrer comment automatiser la capture de time-lapse images à l'aide d'un microscope confocal. Nous décrivons également une méthode pour créer contrôlée, des dommages précis pour chaque branche d'axones sensoriels périphériques chez le poisson zèbre en utilisant la puissance centrée sur un laser femtoseconde monté sur un microscope à deux photons. Les paramètres pour la réussite à deux photons axotomie doit être optimisé pour chaque microscope. Nous allons démontrer à deux photons axotomie la fois sur une mesure construite à deux photons microscope et d'un Zeiss 510 / confocale à deux photons pour fournir deux exemples.

Zebrafish trijumeau neurones sensoriels peuvent être visualisées dans une ligne de transgéniques exprimant la GFP conduit par un promoteur neurone sensoriel spécifique ^1. Nous avons adapté ce modèle de poisson zèbre trijumeau d'observer directement la régénération des axones sensoriels dans la vie des embryons de poisson zèbre. Les embryons sont anesthésiés avec tricaïne et positionnée dans une goutte d'agarose comme il se solidifie. Immobilisé embryons sont scellés dans une chambre remplie d'imagerie phénylthiourée (PTU) de Ringer. Nous avons constaté que les embryons peuvent être continuellement imagée dans ces chambres pour les 12-48 heures. Une seule image confocale est alors capturé afin de déterminer l'endroit désiré de axotomie. La région d'intérêt est située sur le microscope à deux photons par imagerie par les axones sensoriels sous faible, non dommageable pouvoir. Après un zoom avant sur le site désiré de axotomie, la puissance est augmentée et un seul balayage de cette région définie est suffisante pour rompre l'axone. Plusieurs emplacement imagerie time-lapse est alors mis en place sur un microscope confocal d'observer directement la récupération d'une blessure axonale.

Protocol

Partie 1: Montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie

1. Préparer 1% d'agarose Low Melt solution pour incorporer. Dissoudre dans de l'eau DI agarose par chauffage dans un four micro-ondes, partie aliquote dans des tubes de petits et de stocker dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius.
2. Sélectionnez embryons à des fins d'imagerie et d'enlever leurs chorions en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince. Les embryons peuvent être placés dans une solution à 5% Ringer PTU à 22-24 heures après fécondation (HPF) pour inhiber la formation de pigment. Cela améliore la clarté de l'imagerie et est essentielle pour la réalisation à deux photons axotomies des axones sensoriels. Si le pigment naturel est autorisé à se former, l'autofluorescence obscurcit axones sur le microscope à deux photons. Solution de Ringer pour le poisson zèbre contient 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM CaCl _2, et 5 mM d'HEPES, pH 7,2.
3. Anesthetize embryons en ajoutant ~ 0,02% tricaïne à l'Ringer PTU. Faire des animaux que ne sont pas sensibles au toucher avant de procéder.
4. Préparer la chambre de l'imagerie à long terme en appliquant de la graisse à vide d'un côté d'un anneau de verre ou de téflon et se fixer sur une lamelle de verre.
5. Transfert d'un embryon dans la solution 42 degrés agarose avec une pipette en verre, en prenant soin de ne pas transférer une grande partie du PTU Ringer, puis transférer l'embryon avec une goutte d'agarose sur une lamelle de préparation.
6. Position de l'embryon en tant désiré que l'agarose durcit. Gardez à l'esprit que la chambre de l'imagerie sera retourné lorsque vous avez terminé de telle sorte que la lamelle sera la surface supérieure.
7. Si vous avez une platine motorisée et peut emplacement des images multiples à la fois, répétez les étapes 1.4 à 1.6 pour chaque embryon.
8. Laisser l'agarose pour complètement se solidifier, puis remplissez le ring avec 0,02% de Ringer tricaïne PTU.
9. Appliquer de la graisse à vide de l'autre côté de l'anneau (s), puis couvrir l'anneau (s) avec une lame de verre. Retournez la chambre étanche (s) plus. Ces chambres peuvent être utilisés pour l'imagerie des microscopes droits ou inversés.

Partie 2: Deux photons axotomie utilisant une coutume construite à deux photons microscope avec un caméléon Ti-saphir au laser

1. Préparer pour l'imagerie. Placez l'embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec un objectif de l'eau (0,8 NA) 40X. Allumez le laser. Nous avons été en mesure de visualiser et reproductible dommages neurones exprimant la GFP en utilisant les paramètres suivants. Pour visualiser les axones à une puissance non-préjudiciable, mis au laser pour une longueur d'onde de 910 nanomètres (nm) et une puissance de 30 milliwatts (mW énumérées sont la quantité d'énergie à l'échantillon). Ouvrez le logiciel d'imagerie. Nous utilisons un logiciel développé dans le laboratoire scanimage Karel Svoboda ^{2, 3.}
2. Appuyez sur Focus pour numériser l'embryon avec le laser à deux photons, localiser l'axone vous souhaitez axotomize, et de capturer une image de ce axone. Marquer la première et dernière positions Z, d'acquérir l'image, et faire une projection maximale de la pile Z.
3. Zoom 70X sur la branche de l'axone vous souhaitez axotomize et arrêter le balayage. Augmenter la mW à l'échantillon à la puissance de 180 MW d'endommager, et d'effectuer un seul balayage avec le laser. Nous faisons cela en définissant le nombre de tranches de Z à 1 et en appuyant sur "Grab". Cela devrait être suffisant pour rompre l'axone. Voir la discussion des méthodes pour optimiser cette procédure pour votre microscope et le but expérimental.
4. Zoom arrière, réduire la puissance à 30 mW et prendre une image.

Partie 3: deux photons axotomie sur 510 microscope confocal Zeiss / à deux photons

1. Placez montés sur la scène d'embryon et de le mettre en mise au point avec un objectif 25X d'eau ou d'autres objectifs appropriés.
2. Allumez les deux photons (910 nm) et d'argon (488 nm) lasers dans un cadre multi-piste afin qu'il soit possible de basculer de l'un à l'autre. Bien que les deux lasers sont utilisés pour détecter la GFP, l'émission de deux photons est visualisé en rouge, et l'émission laser à l'argon avec du vert pour différencier les deux.
3. Utilisez le laser Argon pour identifier un axone de blesser. Sous Z paramètres marquer la première et la dernière optique. Prenez une image confocale et de créer une projection maximale de la pile Z.
4. Choisissez la région de l'axone d'être blessés et apporter cette région dans le foyer. Eteignez le laser Argon et tournez sur le laser à deux photons. Balayage de l'échantillon avec les deux photons à une intensité laser de transmission ~ 9% de s'assurer que l'axone est encore en discussion.
5. Cliquez sur le bouton «stop» afin que l'outil de recadrage sera disponible. Utiliser des cultures de zoomer sur la zone d'intérêt. Habituellement on fait un zoom 70X à ~ (zoom peut être vérifiée dans le "mode" onglet). Sous l'onglet "Channels" changer l'intensité des deux photons de la transmission ~ 9% à la transmission de 15-20%.
6. Pour rompre un axone activer le «XY rapide" enfoncée pendant environ 1 seconde et puis appuyez sur le bouton d'arrêt pour éviter d'endommager l'excès. L'axone doit être considéré comme des débris dispersés si la procédure a fonctionné.
7. Afin de s'assurer que l'axonea été endommagé revenir au laser Argon à 488 nm, prendre une autre image confocale, et de créer une projection maximale.

Partie 4: confocale imagerie time-lapse sur Zeiss LSM 510

1. Préparer pour l'imagerie. Si vous utilisez une platine chauffante, assurez-vous de l'activer au moins 30 minutes avant la mise en place de votre time-lapse movie. Placez l'embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec l'objectif d'air désirée. Nous utilisons un 20X, 0,5 objective NA. Ouvrez le logiciel d'imagerie Zeiss LSM 510. Allumez les lasers appropriés et mettre en place la configuration souhaitée. Nous allons maintenant décrire un protocole détaillé pour l'imagerie à long terme avec Zeiss LSM logiciel Time Multi. Ces méthodes peuvent être adaptées pour une utilisation sur votre microscope avec votre propre logiciel d'imagerie.
2. Définir la position et la configuration de votre premier embryon dans la fenêtre de temps Multi. Ouvrez le scanner, le stade, et les fenêtres de temps multiples. Activer balayage rapide sur la fenêtre de numérisation. Déplacer la scène à la position XY désiré. Marquer la première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Si vous êtes seulement un embryon d'imagerie, cliquez sur le "Lieu Unique" onglet dans la fenêtre de temps Multi. Cliquez sur "Remplacer XYZ" puis sur "Enregistrer configuration". Convenir lorsqu'on lui a demandé d'écraser la configuration précédente. Passez à l'étape 4.4. Si vous avez une scène mécanisée, vous pouvez configurer de multiples endroits à des embryons de plusieurs images. Dans ce cas, vous devez sélectionner le «Multiple Locations onglet" avant de définir les XYZ et de configuration de votre premier emplacement. Aussi, assurez-vous que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations" onglet situé sur un emplacement 1, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit LOC 1, avant de cliquer sur enregistrer la configuration.
3. Définir la position et la configuration de votre embryons restants dans la fenêtre de temps Multi. Localisez votre embryon suivante, puis appuyez balayage rapide, de déplacer la scène dans la position souhaitée XY, et marquer votre première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Cliquez sur "Remplacer XYZ». Vérifiez que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations" onglet situé sur un emplacement 2, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit Loc 2, puis cliquez sur "Sauvegarder la configuration". Convenir lorsqu'on lui a demandé d'écraser la configuration précédente. Répétez ce processus pour les embryons restants.
4. Définissez les paramètres d'acquisition d'images dans la fenêtre multi Loc. Choisissez l'option GR-GL dans la «Liste des Blocs" section, puis entrez le nombre désiré de répétitions du groupe. C'est le nombre de fois que le confocale va acquérir une image à chaque endroit. Entrez le délai d'attente désirée dans la section Paramètres. C'est la quantité de temps depuis le début d'une répétition d'imagerie pour le début de la prochaine répétition. Sélectionnez "ZStackXY" dans la section de configuration. Entrez votre nom de fichier de base dans la section du bas. Cliquez sur "DB Image Sélectionner" et choisissez votre mdb. Cliquez sur le bouton "Options". Sélectionnez votre dossier mdb d'enregistrer des fichiers temp. Cochez la case "garder l'image finale ouverte", "enregistrer l'image finale», et «milieu de la pile z". Sélectionnez attendre intervalle. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre des options. Cliquez sur "Start Time". Laisser la fenêtre ouverte pour l'heure multi durée de l'imagerie.
5. Analysez vos données. Lorsque l'imagerie time-lapse est terminée, le logiciel Time multi compilera tous vos fichiers temporaires dans un dossier récapitulatif pour chaque emplacement. Si vous voulez arrêter le film avant qu'il ne soit terminé, veillez à appuyer sur «Terminer» au lieu de "Stop", de sorte qu'un fichier de synthèse sera créé. Les fichiers temporaires et fichiers résumé doit être automatiquement enregistré dans le dossier désigné mdb. Dans le menu du logiciel LSM, cliquez sur "View 3D", puis "projection". Avec votre dossier de synthèse sélectionnée dans le menu déroulant, cliquez sur "Appliquer". Cela va générer des projections maximum de la pile Z pour chaque image confocale. Sur le menu du logiciel LSM, cliquez sur "Fichier", puis "Exporter". Enregistrer les projections maximales comme une série de fichiers TIF. Vous pouvez alors créer un film de la série de fichiers tif en utilisant ImageJ ou QuickTime Pro. Les axones dans les images LSM peut être tracé en trois dimensions en utilisant un logiciel d'analyse d'image (par exemple à partir NeuroLucida MicroBrightfield) pour générer des informations quantitatives détaillées sur la morphologie des axones.

Partie 5: Les résultats représentatifs

Une expérience réussie se traduira par une représentation exacte de la dynamique cellulaires de récupération axone d'une blessure. Votre embryons seront en bonne santé après l'imagerie, sans la dégénérescence visible et un battement de coeur solide. Le axotomie devrait entraîner des dommages précis, ne coupant la branche définie de l'axone. Il devrait y avoir aucune blessure aux axones environnante et la mort cellulaire minime. Nous croyons que nous voyons la mort d'une seule cellule épidermique directement sur le site de axotomie dans ~ 50% des expériences. Si vous observez plus de dégâts, vous devriez optimiser vos deux photons du protocole tel que décrit dans la discussion.

Discussion

Nous avons utilisé les méthodes décrites avec précision axotomize périphériques axones sensoriels et d'observer directement la régénération chez l'embryon de poisson zèbre vivant. À long terme time-lapse imagerie confocale chez le poisson zèbre peut être utilisé pour observer les nombreux processus développementaux in vivo. La procédure axotomie deux photons décrit peut être modifié pour de nombreuses différentes objectifs expérimentaux. Nous avons utilisé la même procédure générale pour l'ablation entière du trijumeau corps cellulaires des neurones sensoriels, en zoomant sur le corps de la cellule plutôt que sur une branche de l'axone périphérique. N'importe quel type de cellules identifiables avec la fluorescence peut être précisément endommagées ou ablation avec le pouvoir concentré du laser femtoseconde. Nous nous sommes inspirés pour parfaire ces techniques pour le système de zèbre par des études précédentes dans plusieurs autres systèmes où les lasers pulsés sont utilisés pour créer des dommages localisés ou à l'ablation de cellules ^4,5,6. Dans les expériences de contrôle, nous a confirmé que axotomie est extrêmement précis: nous n'avons jamais endommagées axones à proximité, même quand ils sont des succursales de la même cellule, et seulement occasionnellement endommagé les cellules épithéliales en juxtaposition à proximité des axones. Cette spécificité s'explique par le fait que l'intensité d'excitation à deux photons laser diminue quadratiquement avec la distance du point focal ^3,7. Par ailleurs, puisque l'énergie émise par le fluorophore excité contribue à photovieillissement, entourant cellules non marquées sont susceptibles d'être épargnés.

La puissance du laser nécessaire pour les dommages d'un axone peut varier en fonction de la mise en place du laser, la profondeur des tissus, et votre but expérimental. Si vous souhaitez dommages axones plus profond dans l'embryon, plus de puissance sera nécessaire. Il est préférable de tenter l'axotomie à une faible puissance, puis augmenter progressivement la puissance jusqu'à ce que vous trouverez le montant qui coupera l'axone. Lorsque vous avez déterminé le montant approprié de la puissance laser pour axotomie, vous devriez être en mesure d'utiliser ce pouvoir de façon reproductible laser pour endommager les tissus locaux. Si vous remarquez que le pouvoir du temps sur plus est nécessaire pour créer une axotomie, le laser et du microscope peut exiger de maintenance (par exemple, le laser peut être hors de l'alignement). Assurez-vous que votre laser est correctement aligné, nettoyer votre objectif, et de vérifier les miroirs.