Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Summary

Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Abstract

Zebrafish sono stati a lungo utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo da parte time-lapse imaging del embrione vivente trasparente. Qui si descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging e di dimostrare come automatizzare la cattura di time-lapse immagini utilizzando un microscopio confocale. Abbiamo anche descrivere un metodo per creare controllato e preciso per i danni di singoli rami periferici assoni sensoriali in zebrafish utilizzando la potenza concentrata di un laser a femtosecondi montato su un microscopio a due fotoni. I parametri per il successo a due fotoni assotomia deve essere ottimizzato per ogni microscopio. Dimostreremo a due fotoni assotomia sia su un personalizzato costruito a due fotoni e un microscopio Zeiss 510 / confocale a due fotoni per fornire due esempi.

Zebrafish neuroni sensoriali del trigemino possono essere visualizzati in una linea transgenici che esprimono GFP guidata da un promotore dei neuroni sensoriali specifici ^1. Abbiamo adattato questo modello zebrafish trigemino di osservare direttamente la rigenerazione degli assoni sensitivi in ​​vita embrioni di zebrafish. Embrioni sono anestetizzati con tricaine e posizionato all'interno di una goccia di agarosio come si solidifica. Embrioni immobilizzati sono sigillati all'interno di una camera piena di immagini phenylthiourea (PTU) suonerie. Abbiamo scoperto che gli embrioni possono essere continuamente ripreso in queste camere per 12-48 ore. Una singola immagine confocale viene poi catturato per determinare il sito desiderato assotomia. La regione di interesse si trova sul microscopio a due fotoni per immagini gli assoni sensoriali in basso, che non infligge danno potere. Dopo lo zoom sul sito desiderato assotomia, la potenza è aumentata e una singola scansione di quella regione definita è sufficiente per recidere l'assone. Multiple location time-lapse imaging è quindi impostare su un microscopio confocale per osservare direttamente il recupero da un infortunio assonale.

Protocol

Parte 1: embrioni di zebrafish di montaggio a lungo termine di imaging

1. Preparare 1% bassa temperatura di fusione soluzione di agarosio per l'incorporamento. Sciogliere agarosio in acqua deionizzata da riscaldamento in un forno a microonde, aliquota in tubi piccoli e conservare in un blocco di riscaldamento a 42 gradi Celsius.
2. Selezionare gli embrioni per l'imaging e rimuovere la loro chorions tirando delicatamente il corion a parte con una pinza. Gli embrioni possono essere inseriti in una soluzione al 5% PTU Ringers a 22-24 ore dopo la fecondazione (HPF) di inibire la formazione di pigmento. Ciò migliora la chiarezza delle immagini ed è essenziale per l'esecuzione di due fotoni axotomies degli assoni sensitivi. Se il pigmento naturale è consentito di formare, autofluorescenza oscura assoni sul microscopio a due fotoni. Suonerie soluzione per zebrafish contiene 116 mm NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl ₂ e HEPES 5mm, pH 7,2.
3. Anestetizzare gli embrioni con l'aggiunta di ~ 0,02% tricaine al Ringers PTU. Assicurarsi che gli animali non sono sensibili al tatto prima di procedere.
4. Preparare a lungo termine della camera di imaging mediante l'applicazione di grasso per vuoto ad un lato di un anello in vetro o in teflon e fissaggio su un vetrino di vetro.
5. Trasferimento di un embrione nella soluzione di 42 gradi agarosio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non trasferire gran parte del Ringers PTU, poi trasferire l'embrione con una goccia di agarosio su un vetrino preparato.
6. Posizionare l'embrione come desiderato come l'agarosio si indurisce. Tenete presente che la camera di imaging saranno invertite quando si è fatto in modo che la polizza di copertura sarà la superficie superiore.
7. Se si dispone di uno stadio motorizzato e può posizioni più immagini in una sola volta, ripetere i passaggi 1,4-1,6 per ogni embrione.
8. Lasciare che il agarosio solidificare completamente, quindi riempire l'anello con il 0,02% tricaine Ringers PTU.
9. Ingrassare vuoto dall'altra parte del ring (s), quindi coprire l'anello (s) con una lastra di vetro. Capovolgere la camera stagna (s) finita. Queste camere possono essere utilizzate per l'imaging su microscopi diritta o capovolta.

Parte 2: due fotoni assotomia utilizzando un custom microscopio a due fotoni con un Ti-Sapphire Chameleon laser

1. Prepararsi per l'imaging. Posizionare l'embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con un 40X (0,8 NA) obiettivo di acqua. Accendere il laser. Siamo stati in grado di visualizzare in modo riproducibile e danneggiare i neuroni che esprimono GFP utilizzando i seguenti parametri. Per visualizzare gli assoni a non danneggiare il potere, di laser a una lunghezza d'onda di 910 nanometri (nm) e una potenza di 30 milliwatt (mW elencati sono la quantità di potenza del campione). Aprire il software di imaging. Noi utilizziamo software scanimage sviluppato nel laboratorio di Karel Svoboda ^{2, 3.}
2. Premere il fuoco per eseguire la scansione l'embrione con il laser a due fotoni, individuare l'assone si desidera axotomize, e catturare un'immagine di questo assone. Segnare le posizioni prima e l'ultima Z, acquisire l'immagine, e fare una sporgenza massima delle pile Z.
3. Zoom 70X sul ramo del assone si desidera axotomize e interrompere la scansione. Aumentare la mW a campione per il potenziale nocivo di 180 mW, ed eseguire una singola scansione con il laser. Facciamo questo impostando il numero di fette Z a 1 e premendo "Grab". Questo dovrebbe essere sufficiente per tagliare l'assone. Si veda la discussione di metodi per ottimizzare questa procedura per il microscopio e l'obiettivo sperimentale.
4. Ridurre, ridurre la potenza a 30 mW e scattare una foto.

Parte 3: a due fotoni assotomia il microscopio confocale Zeiss 510 / a due fotoni

1. Luogo embrione montato sul palco e portarlo a fuoco con un obiettivo 25X acqua o altro obiettivo adeguato.
2. Accendere i due fotoni (910 nm) e argon (488 nm) in un ambiente multi-traccia in modo che sia possibile passare da uno all'altro. Sebbene entrambi i laser sono utilizzati per rilevare GFP, i due fotoni emissione viene visualizzata con il rosso e l'emissione argon laser verde per differenziare i due.
3. Usare il laser ad argon per identificare un assone a ferire. Sotto Z impostazioni segnare le sezioni prima e l'ultima ottica. Prendete un immagine confocale e di creare una proiezione massima dello stack Z.
4. Scegli la regione dell'assone di essere feriti e portare questa regione a fuoco. Spegnere il laser Argon e accendere i due fotoni del laser. Scansione del campione con i due fotoni ad una intensità del laser di trasmissione ~ 9% per assicurarsi che l'assone è ancora a fuoco.
5. Fare clic sul pulsante "stop" in modo che lo strumento di ritaglio sarà disponibile. Dell'uso delle colture per ingrandire l'area di interesse. Di solito ci zoom ~ 70X (zoom può essere verificato sotto la scheda "modalità"). Nella scheda "canali" modificare l'intensità dei due fotoni dalla trasmissione ~ 9% al 15-20% di trasmissione.
6. Per tagliare un assone attivare il "fast XY" pulsante per circa 1 secondo e quindi premere il pulsante di arresto per evitare danni in eccesso. L'assone dovrebbe essere visto come detriti sparsi se la procedura ha funzionato.
7. Per garantire che l'assoneè stato danneggiato tornare al 488 nm Argon laser, prendere un'altra immagine confocale, e creare una proiezione massima.

Parte 4: confocale time-lapse imaging Zeiss LSM 510

1. Prepararsi per l'imaging. Se si utilizza uno stadio riscaldato, assicurarsi di accenderlo almeno 30 minuti prima di configurare il time-lapse film. Posizionare l'embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con l'obiettivo d'aria desiderato. Usiamo un 20X, 0,5 obiettivo NA. Aprire Zeiss LSM 510 software di imaging. Accendere il laser appropriato e impostare la configurazione desiderata. Noi ora descrivere un protocollo dettagliato per l'imaging a lungo termine con il software Zeiss LSM Tempo Multi. Questi metodi possono essere adattati per essere utilizzati sul vostro microscopio proprio con il software di imaging.
2. Definire la posizione e la configurazione del vostro primo embrione nella finestra di tempo Multi. Aprire la scansione, lo stadio, e le finestre Tempo Multi. Attivare rapidamente la scansione nella finestra di scansione. Spostare lo stadio fino alla posizione XY desiderata. Segnare le posizioni prima e l'ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Se siete solo un embrione di imaging, clicca sul "Single Location" scheda nella finestra Tempo Multi. Clicca su "Sostituisci XYZ" e poi su "Save Configuration". D'accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Passare al punto 4.4. Se si dispone di un palcoscenico meccanizzato, è possibile impostare diverse posizioni di embrioni immagini multiple. In questo caso, è necessario selezionare il "Multiple Locations" scheda prima di definire la XYZ e la configurazione per la vostra prima posizione. Inoltre, assicurarsi che il menu a tendina appena sotto il "Multiple Locations" scheda è in posizione 1, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 1, prima di fare clic su Salva configurazione.
3. Definire la posizione e la configurazione del vostro embrioni rimanenti nella finestra di tempo Multi. Individuare l'embrione successivo, quindi premere veloce scansione, spostare lo stage nella posizione desiderata XY, e segnare le posizioni prima e l'ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Clicca su "Sostituisci XYZ". Verificare che il menu a tendina appena sotto il "Multiple Locations" scheda è in posizione 2, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 2, quindi fare clic su "Salva configurazione". D'accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Ripetere la procedura per gli embrioni rimanenti.
4. Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini nella finestra Multi Loc. Scegli la GR-GL opzione nella sezione "Elenco delle Blocchi", quindi immettere il numero desiderato di ripetizioni di gruppo. Questo è il numero di volte che il confocale acquisirà l'immagine in ogni sede. Inserire l'intervallo di attesa desiderato nella sezione Parametri. Questa è la quantità di tempo dall'inizio di una ripetizione di imaging per l'inizio della ripetizione successiva. Selezionare "ZStackXY" nella sezione di configurazione. Inserisci il tuo nome base del file nella sezione inferiore. Clicca su "DB Seleziona immagine" e scegli il tuo mdb. Fare clic sul pulsante "Opzioni". Selezionare la cartella mdb per salvare i file temporanei. Check "tenere immagine finale aperto", "salva immagine finale", e "mezzo della pila z". Seleziona aspettare intervallo. Fare clic su OK per chiudere la finestra delle opzioni. Clicca su "Start Time". Lascia finestra Tempo Multi aperta per la durata di imaging.
5. Analizzare i dati. Quando il time-lapse imaging ha finito, il software Multi Ora compila tutti i file temporanei in un file di riepilogo per ogni località. Se si desidera interrompere il film prima che sia completa, assicurarsi di premere il tasto "Fine" invece di "Stop", in modo che un file di riepilogo verrà creato. I file temporanei e file di sintesi deve essere salvato automaticamente nella cartella mdb designata. Dal menu del software LSM, clicca su "View 3D", poi "proiezione". Con il vostro file di riepilogo selezionata nel menu a discesa, fare clic su "Applica". Questo genererà proiezioni massima dello stack Z per ogni immagine confocale. Nel menu del software LSM, cliccare su "File", poi "Esporta". Salva le proiezioni al massimo come una serie di file con estensione tif. Si può quindi creare un film della serie di file tif utilizzando ImageJ o QuickTime Pro. Assoni nelle immagini LSM può essere rintracciata in tre dimensioni utilizzando software di analisi dell'immagine (per esempio NeuroLucida da MicroBrightfield) per generare dettagliate informazioni quantitative sulla morfologia degli assoni.

Parte 5: risultati Rappresentante

Un esperimento riuscito si tradurrà in una rappresentazione accurata della dinamica cellulares di recupero degli assoni da un infortunio. Il tuo embrioni saranno sani dopo l'imaging, senza degenerazione visibile e un battito cardiaco forte. Il assotomia dovrebbe causare danni preciso, solo tagliando il ramo definito dell'assone. Non dovrebbero esserci lesioni al assoni circostante e la morte delle cellule minime. Noi crediamo di vedere la morte di una singola cellula epidermica direttamente sul sito di assotomia in ~ 50% degli esperimenti. Se si osservano più danni, si dovrebbe ottimizzare le due fotoni protocollo, come descritto nella discussione.

Discussion

Abbiamo usato i metodi descritti per axotomize proprio assoni periferici sensoriali e di osservare direttamente la rigenerazione di un embrione in zebrafish vivente. A lungo termine time-lapse confocale in zebrafish può essere usato per osservare molti processi di sviluppo in vivo. I due fotoni assotomia procedura descritta può essere modificata per molti scopi diversi sperimentali. Abbiamo usato la stessa procedura generale per l'ablazione intero trigemino corpi cellulari dei neuroni sensoriali, con lo zoom in sul corpo cellulare, piuttosto che su un ramo degli assoni periferici. Qualsiasi tipo di cellula identificabile con fluorescenza possono essere danneggiate o asportate con precisione con la potenza concentrata del laser al femtosecondo. Siamo stati ispirati per perfezionare queste tecniche per il sistema di zebrafish da studi precedenti in molti altri sistemi in cui sono stati utilizzati laser pulsati per creare danni localizzati o per l'ablazione delle cellule ^4,5,6. In esperimenti di controllo abbiamo confermato che assotomia è estremamente preciso: non abbiamo mai danneggiato assoni vicini, anche quando sono rami della cellula stessa, e solo occasionalmente danneggiato le cellule epiteliali in contrapposizione vicino al assoni. Questa specificità può essere spiegata dal fatto che l'intensità di eccitazione a due fotoni laser cade quadraticamente con la distanza dal punto focale ^3,7. Inoltre, poiché l'energia emessa dal fluoroforo eccitato contribuisce al fotodanneggiamento, che circonda le cellule senza etichetta sono suscettibili di essere risparmiato.

La potenza del laser necessaria per danneggiare un assone può variare a seconda del set up del laser, la profondità dei tessuti, e il vostro obiettivo sperimentale. Se volete danneggiare gli assoni più in profondità l'embrione, più potenza sarà richiesto. E 'meglio tentare la assotomia a bassa potenza, e poi gradualmente aumentare la potenza fino a trovare l'importo che sarà tagliare l'assone. Una volta determinata la giusta quantità di potenza del laser per assotomia, si dovrebbe essere in grado di utilizzare in modo riproducibile questo potere laser per causare danni locale dei tessuti. Se si nota che il potere nel corso del tempo più è necessario per creare un assotomia, il laser e microscopio può richiedere la manutenzione (ad esempio, il laser potrebbe essere fuori allineamento). Assicurarsi che il laser è allineato correttamente, pulire il vostro obiettivo, e controllare gli specchi.