İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Summary

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Zebra balığı uzun zaman atlamalı görüntüleme ile yaşayan şeffaf embriyonun gelişim hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Burada uzun vadeli görüntüleme için zebrafish embriyolar montaj ve konfokal bir mikroskop kullanılarak zaman atlamalı görüntüleri yakalama otomatikleştirmek için nasıl göstermek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz de iki foton mikroskop üzerine monte edilmiş bir femtosaniye lazer odaklı güç kullanarak zebrafish periferik duyusal aksonlar bireysel şube kontrollü, kesin hasar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Başarılı iki foton axotomy için parametreler her mikroskop için optimize edilmiş olmalıdır. Biz iki örnek sağlamak için özel inşa edilen iki foton mikroskop ve Zeiss 510 konfokal / iki-foton hem de iki foton axotomy gösterecektir.

Zebra balığı trigeminal duyusal nöronlar bir duyusal nöron spesifik ¹ organizatörü tarafından yönlendirilen bir transgenik hattı ifade GFP görüntülenebilir. Biz doğrudan doğruya zebrafish embriyolar yaşayan duyusal akson rejenerasyonu gözlemlemek için bu zebrafish trigeminal model adapte var. Embriyolar tricaine ile anestezi ve agaroz bir damla içinde katılaşır olarak konumlandırılmış. İmmobilize embriyolar phenylthiourea (PTU) Zil sesleri ile dolu bir görüntüleme odası içinde mühürlenir. Embriyoların 12-48 saat boyunca sürekli bu odaları görüntülü olduğunu bulduk. Sonra tek bir konfokal görüntü axotomy istenen site belirlemek için yakalanır. Ilgi bölge görüntüleme, düşük, zararlı olmayan güç altında duyusal aksonlar tarafından iki foton mikroskop yer almaktadır. Axotomy istenen sitesinde yakınlaştırma sonra, gücü artar ve tanımlanan bölgenin tek bir tarama akson koparmaya yeterli olur. Çoklu konumu zaman atlamalı görüntüleme sonra yaralanma aksonal kurtarma doğrudan gözlemlemek için bir konfokal mikroskop kurulur.

Protocol

Bölüm 1: uzun vadeli görüntüleme Montaj zebrafish embriyolar

1. Gömmek için% 1 düşük erime agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz DI su ısıtma ile mikrodalga, küçük tüpler ve 42 santigrat derece bir ısıtma bloğu mağaza içine kısım çözülür.
2. Görüntüleme için embriyo seçin ve forseps ile yavaşça dışında koryon çekerek chorions kaldırmak. Embriyolar pigment oluşumunu engellediğini, 22-24 saat sonra döllenme (hpf)% 5 PTU Ringers çözüm içine yerleştirilebilir. Bu görüntü netliği artırır ve duyusal akson iki foton axotomies gerçekleştirmek için çok önemlidir. Doğal pigment formu izin verilirse, otoflöresans iki foton mikroskop aksonlar gizler. Çözüm zebrafish için 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl _2, ve 5mM Hepes, pH 7,2 zilleri.
3. PTU Ringers ~ 0.02% tricaine ekleyerek embriyolar anestezisi. Emin hayvanların devam etmeden önce dokunmaya duyarlı olun.
4. Uzun vadeli, bir tarafı cam veya teflon halka vakum gres yağı uygulayarak ve cam kapak slip üzerine sabitleme görüntüleme odasının hazırlayın.
5. PTU Ringers aktarmak için özen, damlalıklı cam ile 42 derece agaroz çözüm, tek bir embriyo transfer, sonra hazırlanmış bir kapak kayma üzerine bir damla agaroz embriyo transferi.
6. Embriyo agaroz sertleşir olarak istediğiniz gibi yerleştirin. İşiniz bittiğinde görüntüleme odasının kapak kayma üst yüzeyinde olacak şekilde döndürülebiliyorlar, olacağını aklınızda bulundurun.
7. Motorlu bir sahne var ve görüntü tek seferde birden fazla yerde, her bir embriyo için 1,4-1,6 adımları tekrarlayın.
8. Agaroz tamamen katılaşmasını sağlayın, sonra% 0,02 tricaine PTU Ringers halka doldurun.
9. Sonra, bir bardak slayt halka (lar) kapağı halka (lar) diğer tarafında vakum gres yağı uygulayın. Üzerinde mühürlü odası (ler) çevirin. Bu odaların, dik ya da ters mikroskoplar görüntüleme için kullanılabilir.

Bölüm 2: Chameleon Ti-Safir lazer ile özel bir inşa edilen iki foton mikroskop kullanan iki foton axotomy

1. Görüntüleme için hazırlayın. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. 40X (0.8 NA) su amacı ile tek embriyo odaklanın. Lazer açın. Biz tekrarlanabilir görselleştirmek ve aşağıdaki parametreleri kullanarak nöronlar ifade GFP zarar başardık. Aksonlar görselleştirmek için zararlı olmayan bir güç, 910 nanometre dalga boyu (nm) ve 30 bir güç (mW listelenen örnek güç miktarı) miliwatt lazer ayarlayın. Görüntüleme yazılımı açın. Karel Svoboda laboratuarı ^{2, 3} geliştirilen ScanImage Yazılım kullanın.
2. Iki foton lazer ile embriyo tarama odağı basın axotomize isteyen akson bulun ve bu akson bir görüntü yakalamak. Ilk ve son Z konumlarının Mark, görüntü elde Z yığınlarının maksimum projeksiyon yapmak.
3. Tarama axotomize ve durdurmak için istediğiniz akson şube 70X zoom. Örnek mW, 180 mW zararlı güç artırın ve lazer ile tek bir tarama gerçekleştirebilirsiniz. Biz 1 Z dilim sayısını ayarlama ve "tut" tuşuna basarak bunu. Bu akson koparmak için yeterli olmalıdır. Mikroskop ve deneysel amaç için bu yordamı optimize yöntemleri tartışma bakın.
4. Uzaklaştır 30 mW güç azaltmak ve bir görüntü almak.

Bölüm 3: İki foton axotomy Zeiss 510 konfokal / iki foton mikroskop

1. Yeri sahneye embriyo monte edilmiş ve 25X su hedefi veya başka uygun bir amacı kullanarak odak noktası haline getirmek.
2. Birinden diğerine geçiş yapmak mümkün, böylece iki foton (910 nm) ve multi-track bir ortamda Argon (488 nm) lazerler açın. Her iki lazerler GFP tespit etmek için kullanılsa da, iki-foton emisyon kırmızı ile görüntülendi ve yeşil argon lazer emisyon ikisini ayırt etmek için.
3. Argon lazer zarar bir akson tanımlamak için kullanın. Z altında ayarları, ilk ve son optik bölümleri işaretleyin. Konfokal bir görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon Z yığını oluşturmak.
4. Yaralı akson bölge seçin ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Argon lazer kapatın ve iki foton lazer açın. ~ 9% iletim akson odak hala emin olmak için bir lazer yoğunlukta iki foton örnek tarayın.
5. Kırpma aracını satışa sunulacak, böylece "dur" düğmesine tıklayın. Ilgi alanı yakınlaştırmak için kırpma kullanın. Genellikle ~ 70X (zoom "mode" sekmesi altında kontrol edilebilir) yakınlaştırma. "Kanallar" sekmesi altında iki-foton ~% 15-20 iletim% 9 iletim yoğunluğunu değiştirebilirsiniz.
6. Bir akson sever, fazla zarar vermemek için stop düğmesine basın ve sonra yaklaşık 1 saniye ve için "hızlı XY" düğmesini etkinleştirin. Prosedür çalıştı akson dağılmış enkaz olarak görülmelidir.
7. Emin olmak için akson488 nm argon lazer dönmek hasar gördü, bir başka konfokal görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon oluşturmak.

Bölüm 4: Zeiss LSM 510 Konfokal zaman atlamalı görüntüleme

1. Görüntüleme için hazırlayın. Isıtılmış bir aşamada kullanıyorsanız, o zaman-lapse kurmadan önce en az 30 dakika açmak için emin olun. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. İstenen hava amacı ile, tek bir embriyo odaklanın. Biz 20X, 0.5 NA objektif kullanın. Açık Zeiss LSM 510 görüntüleme yazılımı. Uygun lazerler açın ve istenen yapılandırma kurmak. Biz şimdi Zeiss LSM Çok Zaman yazılımı ile uzun vadeli görüntüleme için ayrıntılı bir protokol anlatacağız. Bu yöntemler, görüntüleme yazılımı ile kendi mikroskop kullanım için adapte edilebilir.
2. Çok Zaman penceresinde ilk embriyonun konumu ve yapılandırma tanımlayın. Tarama, sahne ve Çok Zaman pencereleri açın. Hızlı tarama penceresi tarama etkinleştirin. Aşamasında istenen XY konumunu taşıyın. Tarama penceresi ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. Tek bir embriyo tek görüntüleme Çok Zaman penceresinde, "Tek Yer" sekmesini tıklatın. "Değiştir XYZ" üzerine tıklayın ve ardından "Yapılandırma Kaydet". Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. 4.4 adıma geçin. Mekanize bir sahne varsa, görüntü çoklu embriyo birden fazla yerde ayarlayabilirsiniz. Bu durumda, ilk konum için XYZ ve yapılandırma tanımlamadan önce "Birden fazla yerler" sekmesini seçmelisiniz. Ayrıca, "Çoklu Yerler" sekmesi altında açılan menüden konumu 1 açık olduğundan emin olun ve size yapılandırmayı kaydetmek tıklatmadan önce yapılandırma bölümünde açılan menüden, loc 1 adet çok diyor.
3. Çok Zaman pencerede kalan embriyoların konumu ve yapılandırma tanımlayın. Sonraki embriyo bulun, daha sonra, hızlı tarama basın sahneye taşımak istediği XY pozisyonu, ve tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. "Değiştir XYZ" üzerine tıklayın. "Yapılandırma Kaydet" seçeneğini tıklatın, yapılandırma bölümünde açılan menüden çok loc 2 diyor ki, "Birden fazla yerler" sekmesi altında açılan menüden yeri 2 olduğunu kontrol edin ve. Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. Kalan embriyolar için bu işlemi tekrarlayın.
4. Çok Loc penceresinde görüntü elde etmek için parametreleri ayarlayın. "Blok Listesi" bölümünde GR-GL seçeneğini seçin, daha sonra grup tekrarlar istediğiniz numarayı girin. Bu konfokal her yerde bir görüntü elde kaç kez. Parametreler bölümünde istenilen bekleme aralığı girin. Bu, başından itibaren bir görüntü tekrarı sonraki tekrarı başlangıç ​​zaman miktarıdır. Yapılandırma bölümü "ZStackXY" i seçin. Alt bölümünde temel dosya adı girin. "Resim Seç DB" tıklayın ve seçim sizin mdb. "Seçenekler" butonuna tıklayın. Geçici dosyaları kaydetmek için mdb klasörü seçin. Son görüntüyü kaydetmek "ve" z yığınının ortasında "," son görüntüyü açık tutmak "seçeneğini işaretleyin. Aralığı bekleyin seçin. Seçenekler penceresini kapatmak için Tamam tıklayın. "Başlangıç ​​zamanı" üzerine tıklayın. Çok Zaman pencere görüntüleme süresi boyunca açık bırakın.
5. Verileri analiz. Zaman atlamalı görüntüleme tamamlandığında, Çok Zaman yazılımı tüm geçici dosyaları her konum için bir özet dosyası içine derlenir. Tamamlanmadan önce filmi durdurmak istiyorsanız, emin olun, bu yüzden bir özet dosyası oluşturulur olacağını "Dur" yerine "Finish" tuşuna basın. Geçici dosyaları ve özet dosyaları otomatik olarak belirlenen mdb klasöre kaydedilmesi gerekir. LSM yazılım menüsünden, "Projektör", sonra "3D View" üzerine tıklayın. Özet dosyası ile açılan menüden seçilen, "Uygula" yı tıklayın. Bu her konfokal görüntü için Z yığını maksimum projeksiyonları üretecektir. LSM yazılım menüsü, ardından "İhracat", "Dosya" tıklayın. Tif dosyaları bir dizi olarak maksimum projeksiyonları kaydedin. Daha sonra dizi ImageJ veya QuickTime Pro kullanarak tif dosyaları dışında bir film yaratabilir. LSM görüntüler Aksonlar akson morfolojisi hakkında ayrıntılı kantitatif bilgiler üretmek için görüntü analiz yazılımı (örneğin NeuroLucida MicroBrightfield gelen) kullanarak üç boyutlu olarak takip edilebilir.

Bölüm 5: Temsilci sonuçları

Başarılı bir deney hücresel dinamik doğru bir temsili neden olacaktırakson kurtarma yaralanma. Embriyolar görünür dejenerasyon ve güçlü bir kalp atışı, görüntüleme sonra sağlıklı olacaktır. Axotomy sadece akson tanımlanan şube kesilmesinin, kesin hasar görmesine neden olacaktır. Akson ve minimal hücre ölümünü çevreleyen herhangi bir yaralanma olmamalıdır. Biz doğrudan deneylerin ~% 50 axotomy site üzerinden tek bir epidermal hücre ölümü görmek inanıyoruz. Daha fazla zarar gözlemlemek tartışma açıklandığı gibi, iki-foton protokol optimize gerekir.

Discussion

Biz tam periferik duyusal aksonlar axotomize ve oturma zebrafish embriyo rejenerasyon doğrudan gözlemlemek için açıklanan yöntemleri kullanmışlardır. Zebrafish Uzun vadeli zaman atlamalı konfokal görüntüleme in vivo birçok gelişimsel süreçlerini gözlemlemek için kullanılabilir. Açıklanan iki foton axotomy prosedürü, pek çok farklı deneysel amaçları için değiştirilebilir. Biz hücre gövdesi ziyade periferik akson bir şube yakınlaştırma, tüm trigeminal duyusal nöron hücre gövdeleri kesebilme genel olarak aynı prosedür uygulanır. Floresan ile tanımlanabilir herhangi bir hücre tipi tam hasarlı veya femtosecond lazer güç odaklı ile ablasyon olabilir. Biz bu teknikleri, önceki çalışmalarda, darbeli lazerler lokalize hasar oluşturmak ^veya hücreleri 4,5,6 kesebilme birçok diğer sistemler tarafından zebrafish sistem için mükemmel bir ilham edildi. Kontrol deneyleri axotomy son derece hassas olduğunu doğruladı: aynı hücrede dalları bile, yakındaki aksonlar zarar, sadece ara sıra aksonlar yakın yan yana epitel hücrelerinde hasar hiç. Bu özgüllüğü, iki foton lazer uyarım şiddeti odak noktası ^uzaklık 3,7 quadratically düşüyor gerçeği ile açıklanabilir . Heyecanlı fluorofor yayılan enerji fotohasar katkıda beri Ayrıca, çevredeki etiketsiz hücreleri kurtulmuş olması muhtemeldir.

Bir akson zarar için gerekli lazer gücü, lazer, derinlik, doku ve deneysel hedef seti bağlı olarak değişebilir. Embriyo derin aksonlar zarar isterseniz, daha fazla güç gerekli olacaktır. Axotomy düşük bir güçte çalışacak ve sonra akson sever miktarını bulana kadar aşamalı olarak gücünü artırmak için en iyisidir. Bir kez uygun axotomy için lazer enerjisi miktarı, tekrarlanabilir yerel doku hasarına neden bu lazer güç kullanmak gerekir. Bir axotomy zaman içinde daha fazla güç yaratmak için gerekli olduğunu fark ederseniz, lazer ve mikroskobu (örneğin, lazer uyum olabilir) bakım gerekebilir. Lazer düzgün takıldığından emin olun, sizin amacı, temiz ve aynaları kontrol edin.