Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Summary

Här beskriver vi en metod för montering zebrafisk embryon för långsiktig bildbehandling, två-photon avbildning och vävnads-skador tekniker, och Time-lapse konfokala bildhantering.

Abstract

Zebrafisk har länge använts för att studera de cellulära och molekylära mekanismer för utveckling av tidsförlopp avbildning av levande genomskinliga embryot. Här beskriver vi en metod att montera zebrafisk embryon för långsiktig bilder och visa hur man automatiserar tillfångatagandet av tidsförlopp bilder med hjälp av en konfokalmikroskop. Vi beskriver också en metod för att skapa kontrollerade, precisa skador på enskilda grenar av perifer sensorisk axoner i zebrafisk med fokus kraften i en femtosecond laser monterad på en två-photon mikroskop. De parametrar för en lyckad två-photon axotomy måste optimeras för varje mikroskop. Vi kommer att visa två-photon axotomy på både en specialbyggd två-photon mikroskop och en Zeiss 510 konfokala / två-photon att ge två exempel.

Zebrafisk trigeminala sensoriska nervceller kan visualiseras i en transgen linje uttrycker GFP drivs av ett sensoriska neuron specifika promotorn ^1. Vi har anpassat denna zebrafisk trigeminala modell för att direkt observera sensoriska axon förnyelse i levande zebrafisk embryon. Embryon är bedövas med tricaine och placeras i en droppe agaros som den stelnar. Immobiliserade embryon är förseglad i en avbildning kammare fylld med phenylthiourea (PTU) ringsignaler. Vi har funnit att embryon kontinuerligt kan avbildas på dessa avdelningar för 12-48 timmar. En enda konfokala bild då fångas för att bestämma den önskade platsen för axotomy. Regionen av intresse ligger på två-photon mikroskop genom att avbilda de sensoriska axoner under låga, icke-skadande effekt. Efter att zooma in på den önskade platsen axotomy, är kraften ökade och en scan av den definierade regionen är tillräcklig för att bryta axonet. Flera plats time-lapse avbildning är sedan ställa upp på en konfokalmikroskop att direkt observera axonal återhämtning från skador.

Protocol

Del 1: Montering zebrafisk embryon för långsiktig imaging

1. Bered 1% lägre smälta agaroslösningen för inbäddning. Lös upp agaros i DI-vatten genom uppvärmning i en mikrovågsugn, alikvot i små tuber och butik i ett värmeblock vid 42 grader Celsius.
2. Välj embryon för avbildning och ta bort deras chorions genom att försiktigt dra chorion isär med pincett. Embryon kan placeras i en 5% PTU Ringers lösning vid 22-24 timmar efter befruktning (HPF) för att hämma bildandet av pigment. Detta förbättrar tydligheten i bildbehandling och är nödvändig för att utföra två-photon axotomies av sensoriska axoner. Om det naturliga pigmentet får form, döljer autofluorescens axoner på två-photon mikroskop. Ringers lösning för zebrafisk innehåller 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, och 5 mm HEPES, pH 7,2.
3. Bedöva embryon genom att lägga till ~ 0,02% tricaine till PTU ringsignaler. Se till att djur inte är mottaglig för beröring innan du fortsätter.
4. Förbered den långsiktiga avbildning kammare genom att vakuum fett på ena sidan av ett glas eller teflon ringen och fastställa den på en glaskupa halka.
5. Överför ett embryo i 42 graders agaroslösningen med ett glas pipett noga med att inte överföra mycket av PTU Ringers, sedan överföra embryot med en droppe av agaros på en förberedd täcka halka.
6. Placera embryot som önskat som agarosen härdar. Tänk på att den avbildning kammaren kommer att vändas när du är klar, så att locket glida kommer att ovansidan.
7. Om du har en motoriserad skede och kan bild flera platser samtidigt, upprepa steg 1,4-1,6 för varje embryo.
8. Låt agarosen att helt stelna, fyll sedan i ringen med 0,02% tricaine PTU ringsignaler.
9. Applicera vakuum fett på andra sidan av ringen (s), täck sedan ringen (s) med en glasskiva. Vänd på sluten kammare (s) över. Dessa kammare kan användas för avbildning på upprätt eller inverterat mikroskop.

Del 2: Två-foton axotomy hjälp av en specialbyggd två-photon mikroskop med en Chameleon Ti-Sapphire laser

1. Förbered för avbildning. Placera den monterade embryot (s) på en hållare under mikroskop. Fokus på ett embryo med en 40X (0,8 NA) vatten mål. Sätt på lasern. Vi har kunnat reproducerbart visualisera och skador GFP uttrycka nervceller med hjälp av följande parametrar. Att visualisera axoner på en icke-skadlig effekt, som laser in på våglängden 910 nanometer (nm) och en effekt på 30 milliwatt (mW räknas är hur mycket makt på provet). Öppna bildprogram. Vi använder ScanImage Programvara som utvecklats i Karel Svoboda laboratorium ^{2, 3.}
2. Tryck fokus för att skanna embryo med två-photon laser, leta reda på axonet du vill axotomize, och fånga en bild av detta axon. Markera första och sista Z positioner, hämta bilden, och göra en maximal projektion av Z-stackar.
3. Zooma in 70x på grenen av axonet du vill axotomize och stoppa scanning. Öka mW vid urvalet till de skadliga effekt på 180 MW och göra en scan med laser. Vi gör detta genom att ställa in antalet Z skivor till en och trycka på "Grab". Detta borde vara tillräckligt för att bryta axonet. Se diskussion om metoder för att optimera den här proceduren för din mikroskop och experimentell mål.
4. Zooma ut, minska strömmen till 30 mW och ta en bild.

Del 3: Två-foton axotomy på Zeiss 510 konfokala / två-photon mikroskop

1. Placera monteras embryo på scenen och få det att fokusera med hjälp av en 25X vatten objektiv eller annat lämpligt mål.
2. Slå på två-photon (910 nm) och Argon (488 nm) lasrar i en multi-track inställning så att det är möjligt att byta från den ena till den andra. Även om båda lasrar används för att upptäcka GFP, är två-photon emission visualiseras med röda och argon laser utsläpp med gröna för att skilja de två.
3. Använd Argon laser för att identifiera en axon att skada. Enligt Z-inställningar markerar den första och sista optiska sektioner. Ta en konfokala bild och skapa en maximal projektion på Z stacken.
4. Välj den region i axonet att skadas och föra denna region i fokus. Stäng av Argon laser och slå på två-photon laser. Scan provet med två-photon på en laser intensitet på ~ 9% transmission för att säkerställa att axonet är fortfarande i fokus.
5. Klicka på "Stop" knappen så att beskärningsverktyget kommer att finnas tillgängliga. Använd gröda att zooma in på det intressanta området. Vanligtvis vi zoomar till ~ 70x (zoom kan kontrolleras under "mode"-fliken). Under "kanaler" fliken ändra intensiteten av de två-photon från ~ 9% transmission till 15-20% transmission.
6. Att bryta ett axon aktivera "fast XY"-knappen i cirka 1 sekund och sedan trycka på stoppknappen för att undvika överskott skador. Axonet ska ses som spridda skräp om förfarandet fungerade.
7. För att säkerställa att axonetvar skadad växla tillbaka till 488 nm Argon laser, ta en annan konfokala bild och skapa en maximal projektion.

Del 4: Confocal tidsförlopp avbildning på Zeiss LSM 510

1. Förbered för avbildning. Om du använder en uppvärmd stadium, se till att slå på den i minst 30 minuter innan du ställer in time-lapse film. Placera den monterade embryot (s) på en hållare under mikroskop. Fokus på ett embryo med önskad luft målet. Vi använder en 20x, 0,5 NA mål. Öppna Zeiss LSM 510 bildprogram. Slå på lämpliga lasrar och ställa in önskad konfiguration. Vi ska nu beskriva ett detaljerat protokoll för långsiktig avbildning med Zeiss LSM Multi Time. Dessa metoder kan anpassas för användning på egen hand mikroskop med ditt bildprogram.
2. Definiera placering och konfiguration av din första embryo i Multi tidsfönster. Öppna skanna, scenen, och Multi fönster tid. Aktivera snabb skanning på Skanna. Flytta scenen till önskad XY läge. Markera första och sista Z positioner i Skanna. Tryck på stopp, sedan mitten även i Skanna. Vänta tills skanningen av mitt Z-slice för att avsluta, tryck sedan markera position på scenen fönster. Om du bara imaging ett embryo, klicka på "samma plats"-fliken i Multi tidsfönster. Klicka på "Ersätt XYZ" och sedan på "Spara konfiguration". Överens om när de ombads att skriva över den föregående konfigurationen. Gå vidare till steg 4,4. Om du har en mekaniserad stadium, kan du ställa in flera platser för att bild flera embryon. I så fall bör du välja "Flera platser"-fliken, innan de definierar XYZ och konfigurationen för din första plats. Se också till att rullgardinsmenyn nedanför "Flera platser" fliken är på plats 1, och att rullgardinsmenyn i avsnittet Konfiguration säger flera lok 1, innan du klickar på Spara konfiguration.
3. Definiera placering och konfiguration av resterande embryon i Multi tidsfönster. Hitta din nästa embryo och tryck snabbt skanna, flytta scenen till önskad XY läge och markera din första och sista Z positioner i Skanna. Tryck på stopp, sedan mitten även i Skanna. Vänta tills skanningen av mitt Z-slice för att avsluta, tryck sedan markera position på scenen fönster. Klicka på "Ersätt XYZ". Kontrollera att rullgardinsmenyn nedanför "Flera platser" fliken är på plats 2, och att rullgardinsmenyn i avsnittet Konfiguration säger flera lok 2, klicka sedan på "Spara konfiguration". Överens om när de ombads att skriva över den föregående konfigurationen. Upprepa denna process för resten embryon.
4. Ställ in parametrar för bildtagning i Multi Loc fönstret. Välj GR-GL alternativet i "Lista över Blocks" sektionen, och ange önskat antal gruppens repetitioner. Detta är det antal gånger konfokala kommer att få en bild på varje plats. Ange önskad vänta intervall i Parametrar sektionen. Detta är den tid från början av en avbildning upprepning till början av nästa repetition. Välj "ZStackXY" i konfigurationen avsnitt. Skriv du baserar filnamnet i den nedre delen. Klicka på "Välj bild BF" och välj din MDB. Klicka på knappen "Alternativ". Välj din mdb mapp för att spara temporära filer. Kolla "hålla slutliga bilden öppen", "spara slutliga bilden" och "mitt i Z stacken". Välj vänta intervall. Klicka på OK för att stänga fönstret Alternativ. Klicka på "starttid". Lämna Multi Dags fönstret öppet för länge avbildning.
5. Analysera dina data. När tidsförlopp imaging är klar, kommer Multi Time sammanställa alla dina temporära filer i en sammanfattande fil för varje plats. Om du vill stoppa filmen innan den är klar ska du trycka på "Finish" istället för "Stop", så att en sammanfattning fil kommer att skapas. Den temporära filer och sammanfattningen bör sparas automatiskt till den angivna MDB mappen. Från LSM programvarumeny, klicka på "3D-vy" och sedan "Projektion". Med sammanfattning fil valts i rullgardinsmenyn, klicka på "Apply". Detta kommer att generera maximal projektioner av Z stacken för varje konfokala bild. På LSM programvarumeny, klicka på "File" och sedan "Export". Spara den maximala prognoser som en serie av TIF-filer. Du kan sedan skapa en film av serien av TIF-filer med ImageJ eller QuickTime Pro. Axoner i LSM bilder kan spåras i tre dimensioner med hjälp av programvara bildanalys (t.ex. NeuroLucida från MicroBrightfield) för att generera detaljerade kvantitativa uppgifter om Axon morfologi.

Del 5: representativa resultat

Ett lyckat experiment kommer att resultera i en korrekt bild av det cellulära dynamiskas av Axon återhämtning från skador. Din embryon blir friska efter avbildning, utan synligt degeneration och en stark hjärtslag. Det axotomy ska resultera i exakt skada, bara bryta definierade gren av axonet. Det bör inte skada omgivande axoner och minimal celldöd. Vi tror att vi ser döden av en enda epidermala celler direkt över platsen för axotomy i ~ 50% av experiment. Om du ser mer skada, bör du optimera dina två-photon-protokoll som beskrivs i diskussionen.

Discussion

Vi har använt de metoder som beskrivs exakt axotomize perifer sensorisk axoner och att direkt observera förnyelse i den levande zebrafisk embryot. Långfristiga tidsförlopp konfokala imaging i zebrafisk kan användas för att observera många utvecklingsprocesser in vivo. De två-photon axotomy som beskrivs kan modifieras på många olika experimentella mål. Vi har använt samma allmänna förfarandet för att avlägsna hela trigeminus sensoriska organ neuron cell, genom att zooma in på cellkroppen snarare än på en gren i det perifera axonet. Alla celltyper som kan hänföras till fluorescens kan vara exakt skadad eller borttagen med fokus makt femtosecond laser. Vi blev inspirerade att fullända dessa tekniker för zebrafisk systemet genom tidigare studier i flera andra system där pulsade lasrar har använts för att skapa lokala skador eller för att avlägsna celler ^4,5,6. I kontroll experiment har vi bekräftat att axotomy är extremt exakt: vi har aldrig skadat närliggande axoner, även när de är grenar av samma cell, och bara ibland skadade epitelceller i nära juxtaposition till axoner. Denna särställning kan förklaras av det faktum att intensiteten från två-photon laser excitation sjunker kvadratiskt med avståndet från centrum ^3,7. Eftersom energi som avges från glada fluoroforen bidrar till fotoskador, omgivande utan etikett celler sannolikt kommer att skonas.

Lasern effekt för att skada en axon kan variera beroende på inrättandet av lasern, djupet av vävnaden, och din experimentell mål. Om du vill skada axoner djupare i embryot, blir mer kraft behövs. Det är bäst att försöka att axotomy på en låg effekt, och sedan stegvis öka kraften tills du hittar det belopp som kommer skära axonet. När du har bestämt lämplig mängd av laser makt för axotomy, bör du kunna reproducerbart använda laser makt för att orsaka lokal vävnadsskada. Om du märker att med tiden mer kraft krävs för att skapa en axotomy kan laser och mikroskop kräver underhåll (till exempel, kan laser vara ur läge). Se till att din laser är korrekt inställd, rengöra objektiv och kontrollera speglarna.