Summary
HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。パート3は、蛍光色素のアミノアリルカップリングにより、両方のホストとウイルスのサンプルから増幅されたRNAを標識するプロセスを説明します。 3のパート3。
Abstract
家族の
Protocol
パート1：aRNAの標識：色素のアミノアリルカップリング
- 1.5ml微量遠心チューブにaRNAのサンプルの1μgのを追加。
- 彼らは完全に乾燥されるまで低いかゼロの熱で試料をドライ真空。とすぐに乾燥しているとして、各チューブにフタを- 乾燥し過ぎたしないでください！
- 各チューブに9μlカップリング緩衝液を加え、穏やかに1分間ボルテックスでaRNAを再懸濁します。チューブの底にサンプルを収集するために手短に遠心し、サンプルが氷の上に座ってみましょう。
- Cy3またはCy5色素の各チューブに22μlの高品質のDMSOを追加。染料の一管は十分な2サンプル用です。 Cy3標識色素は、参照試料を標識するためです、とCy5色素は、テストサンプルを標識するためです。
- 渦染料が完全に混合する。使用する準備ができるまで暗闇の中で染料を保管してください。使用する前に、前の1時間より染料を用意しないでください。水がどの時点でも染料/ DMSO混合で取得しないことを確認します。
- 各サンプルに準備DMSO / Cyの染料の11μlを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。
- 室温で30〜45分インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。
- インキュベーション後、反応をクエンチするために各サンプルに4.5μlhydroxlyamineを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。
- 室温でさらに15分間インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。
パート2：aRNAのクリーンアップ標識
- 簡単に渦RNA結合ビーズを使用前であっても混合物を得ること。
- 室温でaRNAの結合ミックスを準備します。（表1）
- ボルテックスでよく混ぜる。
- 少なくとも10分間50〜60℃で1.5mlチューブとインキュベートにaRNAの溶出バッファーをAliquote。
- 各サンプルにaRNAの結合ミックスの70μlを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- PCRプレートから96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。
- 各サンプルに100％イソプロパノール50μlのを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- やさしく徹底的にサンプルを混ぜるために、少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振る。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。上清は、明るいピンク色または非法人の色素分子のためにこの時点では明るい青のいずれかでなければなりません。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 各ウェルに100μlのaRNAの洗浄液を追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、完全にこの段階では分散されないことがあります。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 100μlのaRNAの洗浄溶液で洗浄2回目のタイムを繰り返します。
- 第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカー上で1分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。サンプルを乾燥し過ぎたしないでください！
- 各サンプルに20μlの予熱aRNAの溶出バッファーを添加することによりビーズからaRNAのを溶出する。
- 精力的に3分間オービタルシェーカー上でプレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。
- 磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。上清は、クリーンアップ、ラベルされたaRNAのサンプルが含まれており、淡いピンクや淡いブルーのどちらかでなければなりません。
- 慎重に新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に溶出されたaRNAを転送します。
- （オプションの手順）は、マイクロアレイのモジュールを使用して光度計分光光度計に1.5μlずつを測定することにより、サンプル中のRNAの濃度と色素の量を確認してください。
- あなたがハイブリダイゼーションのための準備が整うまではすぐに代わりにお好みのマイクロアレイプラットフォームにラベル付けaRNAをハイブリダイズする、または、あなたは、-80 ° Cで標識したaRNAを保存することができます。
表1 aRNAをバインドミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| RNA結合ビーズ* | 10μlの |
| ビーズの再懸濁ソリューション* | 4μl |
| 100％イソプロパノール** | 6μl |
| aRNAの結合バッファー濃縮液 | 50μlの |
*とRNA結合ビーズをミックスビーズ懸濁液第一
**イソプロパノールを追加し、aRNAの結合バッファー濃縮液を添加する前によく混ぜる。
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Discussion
重要なステップ
アミノアリルカップリングを実行するとき、それはカップリングの前にすぐにDMSO（1時間未満）で色素を再懸濁し、それが染料でアクティブグループと反応するので、水が、染料/ DMSO混合に入ったことを確認するため、重要です。 RNAを（1 - 2uLではなく、完全に乾燥するまで乾燥することができます）乾燥し過ぎた、そしてカップリングバッファにうまく懸濁しないでください。カップリング反応中に、時折のフリックで、暗所で反応を維持し、必要に応じてスピンダウン。
アプリケーション/意義
このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。
カスタム設計されたポックスウイルスの配列1を使用して 、我々は、ウイルスDNAの複製は、転写産物の検出に必要なされたかどうかを"早期"か"遅い"のハイブリダイゼーションシグナルのタイミングに基づいての一般的なカテゴリに遺伝子を分類することができた。我々は、転写の正確なタイミングに、各時間のクラスでの遺伝子の予想される機能カテゴリ（すなわち、初期の中間と後期遺伝子を期待される）の変動を観察した。
この作業で利用されるメソッドは、早期または複製サイクルの後半で転写、ウイルスの遺伝子を予測することはできますが、デュアル初期/後期プロモーターと転写産物が解消されないとなる可能性があるため初期および後期プロモーターによる遺伝子対の早期のみ区別する多くの困難を持っている遅い時間に検出された。配列にハイブリダイズするRNAは、指定されたORFまたは上流のORFから来ている可能性があるのでさらに、後期ウイルス遺伝子の転写を介して実行には、アレイ上の特定のプローブ/スポットで信号に影響を及ぼす可能性があります。タイル配列はこの問題を解決しようとした、しかし課題は、ハイブリダイゼーションベースの手法2,3,4を用いて転写を介して実行検出に残ります。
ホスト転写パターンも、これらの方法を用いて評価することができる。しかし、ワクシニア、ホストの応答を抑制するためのさまざまなメカニズムをエンコードし、宿主の転写反応は、他の刺激5,6,7,8に比べて短くなる可能性があります。宿主防御に関与する多くの遺伝子の発現は感染後に変更されているため、宿主の免疫応答を打ち消すのウイルス遺伝子の寄与は、したがって、考慮する必要があります。
これらのメソッドを利用して、すべてのウイルス遺伝子の転写タイミングのマップが同定され、未知のウイルス遺伝子の機能を調べるために使用することができます。さらに、これらの方法は、ウイルスと宿主との間の複雑な対話を分析するために利用することができます。これらのメソッドは、他の宿主 - 病原体の感染システムに広く適用可能である。興味のある病原体は、ポリアデニル化mRNAを持っていない場合は、代替法は線形増幅することなく、直接トータルRNAを標識するために使用することができます。同期感染時の両方のホストとウイルスの遺伝子発現を解析することによって、これらのメソッドは、私たちはウイルス感染に対する宿主細胞環境だけでなく、ホストカウンター防御とウイルスの相互作用を把握することができます。
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Acknowledgments
ホワイトヘッド研究所フェローファンド
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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