Summary
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.
Abstract
La famiglia
Protocol
Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti
- Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml.
- Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - non asciugare eccessivamente!
- Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio.
- Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. Un tubo di colorante è sufficiente per 2 campioni. Il colorante è Cy3 per etichettare i campioni di riferimento, e il colorante Cy5 è per etichettare i campioni di prova.
- Vortex le tinture per mescolare completamente. Mantenere i coloranti al buio fino al momento dell'uso. Non preparare colorante prima di 1 ora prima dell'uso. Assicurarsi che l'acqua non arriva in tinta / DMSO mix in qualsiasi momento.
- Aggiungere 11μl del preparato DMSO / Cy colorante per ogni campione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza.
- Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l'esposizione alla luce.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 4.5μl hydroxlyamine ad ogni campione di spegnere la reazione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza.
- Incubare per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l'esposizione alla luce.
Parte 2: Labeled ARNA clean-up
- Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell'uso.
- Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente. (Tabella 1)
- Mescolare bene nel vortex.
- Aliquote Buffer ARNA eluizione in una provetta 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti.
- Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolante per ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto.
- Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. Il sopranatante deve essere un rosa brillante o un blu brillante a questo punto a causa della molecole di colorante senza personalità giuridica.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con la soluzione di 100μl Wash ARNA.
- Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni!
- Eluire la ARNA dalle perle con l'aggiunta di 20μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione.
- Agitare vigorosamente la piastra l'agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare.
- Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene il pulito, campioni ARNA etichettati, e dovrebbe essere un rosa pallido o di un azzurro pallido.
- Trasferire accuratamente l'ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi).
- (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop utilizzando il modulo Microarray.
- Immediatamente ibridare l'ARNA etichetta su una piattaforma microarray di vostra scelta, o, in alternativa, è possibile memorizzare l'ARNA etichettati a -80 ° C fino a quando si è pronti per l'ibridazione.
Tabella 1 ARNA Mix Binding
| Reagente | Importo per 1 reazione |
| Perline RNA Binding * | 10μl |
| Bead Resuspension * Soluzione | 4μl |
| 100% isopropanolo ** | 6μl |
| ARNA Concentrato Binding Buffer | 50μl |
* Mescolare le perline RNA legame con latallone soluzione risospensione prima
** Aggiungere l'isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.
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Discussion
Passaggi critici
Quando si esegue l'accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell'accoppiamento e garantire l'acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l'RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tenere la reazione al buio, con flicking occasionali e spin giù se lo si desidera.
Applicazione / Significato
L'RNA etichettati derivanti dal presente protocollo può essere ibridato a uomo, microarray virale, o personalizzate per valutare le risposte di espressione genica di cellule infette in coltura. Piattaforma Microarray variare, quindi seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della miscela di ibridazione dalla sonda marcata.
Utilizzando una matrice personalizzata poxvirus progettato 1, siamo stati in grado di classificare i geni nelle categorie generali di "early" o "in ritardo" in base alla temporizzazione di segnale di ibridazione e se non la replicazione del DNA virale è stato richiesto per il rilevamento di trascrizione. Abbiamo osservato le categorie atteso funzionali di geni in ciascuna classe temporale (ad esempio, prevede geni precoci, intermedio e in ritardo) variazione per quanto riguarda la tempistica esatta trascrizione.
I metodi utilizzati in questo lavoro sono in grado di predire geni del virus trascritti anticipo o in ritardo nel ciclo di replicazione, ma hanno più difficoltà a distinguere precoce solo contro i geni con un promotore precoce e tardiva poiché trascrizioni con un doppio inizio / fine del promotore può persistere ed essere rilevato, a volte in ritardo. In aggiunta, run-through trascrizione di geni virali in ritardo può influire segnale a una sonda data / spot sulla matrice, come l'RNA ibridazione alla matrice può provenire dal designato ORF o un monte ORF. Array piastrelle hanno tentato di risolvere il problema, tuttavia le sfide restano nella rilevazione attraversano la trascrizione utilizzando approcci basati ibridazione 2,3,4.
Modelli di ospitare trascrizionale può essere valutata anche con questi metodi. Tuttavia, vaccinia codifica per una varietà di meccanismi per inibire le risposte di accoglienza, e le risposte ospitare trascrizionale può essere ridotta rispetto ad altri stimoli 5,6,7,8. Dal momento che l'espressione di molti geni coinvolti nella difesa ospite è alterata dopo l'infezione, il contributo dei geni virali che contrastare risposta immunitaria dovrebbe quindi essere presa in considerazione.
Utilizzando questi metodi, una mappa dei tempi di trascrizione di tutti i geni virali possano essere identificati e usato per interrogare funzioni dei geni virali sconosciute. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati per sezionare il dialogo intricato tra virus e ospite. Questi metodi sono generalmente applicabili ad altri sistemi ospite-patogeno infezione. Se l'agente patogeno di interesse non ha polyadenylated mRNA, metodi alternativi possono essere usati per etichettare direttamente la RNA totale, senza amplificazione lineare. Attraverso l'analisi sia di accoglienza e di espressione genica del virus durante l'infezione sincrona, questi metodi ci permettono di ottenere informazioni in interazione del virus con l'ambiente host cellulare così come contro-ospite difese contro le infezioni da virus.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fondi
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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