Summary
Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm 3
Abstract
Aile
Protocol
Bölüm 1: Arna etiketleme: boyaların amino alil kaplin
- 1.5mL mikrosantrifüj tüpler içine Arna örnekleri 1μg ekleyin.
- Tamamen kuruyana kadar, hiç olmaması veya düşük ısı örnekleri kuru vakum. En kısa sürede kuru olarak her tüp kap - overdry yok!
- Her bir tüp 9μl kaplin tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca yavaşça karıştırın Arna tekrar süspansiyon haline getirin. Tüpün alt örnek toplamak için kısaca santrifüjleyin ve sonra örnek buz üzerinde bekletin.
- Cy3 veya Cy5 boya her tüp 22μl yüksek kalite DMSO ekleyin. Bir tüp boya 2 örnek için yeterli. Referans örnekleri etiketleme için Cy3 boya ve Cy5 boya, test örnekleri etiketleme için.
- Iyice karıştırın boyalar Vortex. Kullanıma hazır olana kadar koyu boyaları tutun. Kullanmadan önce 1 saat daha erken boya hazırlamak etmeyin. Herhangi bir noktada boya / DMSO karışımı hiç su alır emin olun.
- Her bir numune için hazırlanan DMSO / Cy boya 11μl ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız.
- 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın.
- Inkübasyondan sonra, tepkisini gidermek için her bir örnek 4.5μl hydroxlyamine ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız.
- Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın.
Bölüm 2: Arna temiz-etiketli
- Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için.
- Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 1) .
- Vorteks ile iyice karıştırın.
- En az 10 dakika süreyle, 50-60 ° C'de bir 1.5mL tüp ve inkübe Arna Elüsyon Tampon Aliquote.
- Her bir örnek 70μl Arna bağlayıcı karışımı ekleyin ve 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme iyice karıştırın.
- PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
- Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın.
- Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. Süpernatant parlak pembe ya da tüzel kişiliği olmayan boya molekülleri nedeniyle bu noktada bir parlak mavi olmalıdır.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın.
- 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin!
- Her numune için 20μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir.
- 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
- Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş, etiketli Arna örnekleri içerir ve bir soluk pembe ya da soluk mavi olmalıdır.
- Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın.
- (Opsiyonel adım) Mikroarray modülü kullanılarak NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinde RNA konsantrasyonu ve boya miktarını kontrol edin.
- Hemen sizin seçtiğiniz bir mikroarray platformu üzerine etiketli Arna melezleşme ya da alternatif olarak, -80 etiketli Arna depolamak ° C hibridizasyon için hazır olana kadar.
Tablo 1 Arna Bağlama Mix
| Reaktif | 1 reaksiyon için Tutarı |
| RNA Cilt Boncuk * | 10μl |
| Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * | 4μl |
| % 100 izopropanol ** | 6μl |
| Arna Cilt Tampon Konsantre | 50μl |
* RNA bağlayıcı boncuk Mixilk boncuk tabanda çözüm
** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik Adımlar
Amino alil kaplin yaparken, kaplin önce kısa bir süre DMSO (1 saatten az) boya tekrar süspansiyon ve aktif boya grubu ile reaksiyona girer hiçbir su, boya / DMSO karışımı içine alır sağlamak için kritik öneme sahiptir. RNA (1-2uL yerine tamamen kuru aşağı kurutulmuş olabilir) overdry ve kaplin tampon tekrar süspansiyon haline getirin. Kaplin reaksiyon sırasında, zaman zaman Flicking, karanlıkta reaksiyon tutmak ve istenirse aşağı doğru döndürün.
Uygulama / Önemi
Bu protokol sonucu etiketli RNA gen ekspresyonu yanıtları değerlendirmek için kültür enfekte hücreleri insan, viral veya özel mikroarray'ler melezleşmiştir olabilir. Mikroarray platformları değişir, bu nedenle etiketli prob hibridizasyon karışımının hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin.
Özel olarak tasarlanmış bir poxvirus dizi 1 kullanarak, genler viral DNA replikasyonu transkript tespiti için gerekli olup olmadığını ya da "erken" ya da "geç" hibridizasyon sinyali zamanlaması dayalı ve genel kategoride sınıflandırmak için başardık. Biz her zaman sınıf genlerin transkripsiyon kesin olarak beklenen fonksiyonel kategoriler (yani, erken, orta ve geç genlerin beklenen) değişimi gözlemledik.
Bu çalışmada kullanılan yöntemler devam ediyor ve erken ya da geç çoğaltma döngüsü transkripsiyonu virüs genleri tahmin etmek mümkün olabilir, ancak transkript beri çift geç / erken organizatörü ile erken ve geç bir yararlanıcı genlerin karşı daha fazla zorluk sadece erken ayırt Geç zaman algılandı. Buna ek olarak, diziye literatürde RNA belirlenen ORF veya yukarı yönde bir ORF gelmiş gibi geç viral genlerin transkripsiyon ile çalıştırmak, dizi belirli bir prob / noktada sinyal etkileyebilir. Fayans dizileri bu sorunu çözmek için çalıştılar, ancak zorlukları hibridizasyon temelli yaklaşımlar 2,3,4 kullanarak transkripsiyon yoluyla çalıştırılan tespit kalır.
Ev Sahibi transkripsiyonel desenler de bu yöntemler kullanılarak tespit edilebilir. Ancak, vaccinia Konak yanıtları inhibe mekanizmaları çeşitli kodlar ve ev sahibi transkripsiyonel yanıtları diğer uyaranlara 5,6,7,8 göre azalabilir. Konak savunmasında yer alan birçok genin ifadesi enfeksiyondan sonra değişmiş olduğundan, konağın immün yanıtları karşı viral genlerin katkısı bu nedenle dikkate alınması gerekir.
Bu yöntemler kullanılarak, tüm viral genlerin transkripsiyonel zamanlama bir harita tespit ve bilinmeyen viral genlerin fonksiyonlarını sorgulamak için kullanılan olabilir. Buna ek olarak, bu yöntemler karmaşık virüs ve ev sahibi arasındaki diyalogu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemler, genel olarak diğer konak-patojen enfeksiyon sistemleri için geçerlidir. Ilgi patojen mRNA'ların polyadenylated yoksa, alternatif yöntemler doğrusal amplifikasyon olmadan, doğrudan toplam RNA etiketlemek için kullanılan olabilir. Hem ev sahibi ve Senkron enfeksiyon sırasında virüs gen ekspresyonu analiz ederek, bu yöntemler bize virüs bulaşmasına karşı konak hücre ortamının yanı sıra bilgisayar karşı savunmasını virüs etkileşim içgörü kazanmak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
