Summary
协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。第3部分介绍了从主机和染料的氨基烯丙基耦合病毒样本的荧光标记扩增的RNA的过程。
Abstract
家庭
Protocol
第1部分：ARNA标签：染料的氨基烯丙基耦合
- 添加到1.5ml离心管ARNA样品1μg。
- ，直到它们完全干燥，真空干燥的样品低或无热量。第每个管，只要它是干的-不 overdry！
- 每管加入9μl耦合缓冲和重悬轻轻振荡1分钟的ARNA。短暂离心收集样品在试管底部，然后让样品坐冰。
- 加入22μl高品质二甲基亚砜每个管Cy3或Cy5的染料。染料管够2个样品。 Cy3标记的染料为您的参考样本标签，标签测试样品和Cy5的染料。
- 涡染料调匀。在黑暗中保持，直到准备使用的染料。不要前的准备使用的染料早1个多小时。确保没有水混合染料/ DMSO在任何时候获取。
- 每个样品准备二甲基亚砜/ CY染料添加11μl。涡旋轻轻拌匀。
- 孵育室温为30-45分钟。用锡纸盖的样品或保持在一个抽屉里，以尽量减少暴露在光线下。
- 孵化后，每个样品中加入4.5μlhydroxlyamine淬火反应。涡旋轻轻拌匀。
- 孵育15分钟在室温。用锡纸盖的样品或保持在一个抽屉里，以尽量减少暴露在光线下。
第2部分：标记ARNA清理
- 旋涡RNA结合珠简要地获取，使用前均匀混合。
- 准备ARNA绑定混合，在室温下（见表1 ）。
- 由涡旋混合。
- 成1.5ml离心管，并在50-60℃孵育至少10分钟Aliquote ARNA洗脱缓冲液。
- 每个样品添加ARNA约束力混合70μl，拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 样品PCR板转移到一个96孔的圆底板。
- 100％异丙醇每个样品中加入50μL拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 轻轻摇动至少2分钟，轨道摇床板，彻底混合样品。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。离开盘上的立场，直到混合物变得透明和约束力珠颗粒。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。上清应该是明亮的粉红色，或在这一点上，由于非法团的染料分子的明亮的蓝色。
- 删除从磁立场板。
- 加入100μLARNA每口井的清洗液，摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠可能无法完全分散在这一步。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
- 删除从磁立场板。
- 重复100μLARNA清洗液洗了第二 。
- 之后的第2 次洗，干燥摇晃以最快的速度为1分钟的轨道摇床板的珠子。不要overdry的样品！
- 每个样品加入20μL预热ARNA洗脱液洗脱珠ARNA。
- 大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。
- 一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。上清包含清理，标记ARNA样本，而应该是一个淡粉色或淡蓝色。
- 洗脱ARNA小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）。
- （可选步骤）检查所使用芯片模块上的一个NanoDrop分光光度计测量1.5μl的样品中的RNA浓度和染料用量。
- 立即到您所选择的芯片平台的杂交标记ARNA，或者，您可以标记ARNA储存于-80 ° C，直到你准备进行杂交。
表1绑定混合ARNA
| 试剂 | 金额为1反应 |
| 核糖核酸*装订珠 | 加入10μl |
| 珠再悬浮解决方案* | 4μl |
| 100％的异丙醇** | 6μl |
| ARNA绑定缓冲液 | 50μL |
*与RNA结合珠的混合珠再悬浮的解决方案第一
**添加异丙醇和拌匀之前加入ARNA结合缓冲液。
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Discussion
关键步骤
执行氨基烯丙基耦合时，关键是重悬在二甲基亚砜在短期内（少于1小时）前耦合的染料，并确保没有水进入染料/ DMSO混合，因为它会与染料的活性基团反应。不要overdry RNA（可干1 2uL，而不是完全干燥），以及在耦合缓冲液重悬。在偶联反应过程中，不断在黑暗中的反应，偶尔弹和自旋向下，如果需要。
应用程序/意义
人类，病毒，或自定义芯片杂交标记的RNA可以从本议定书，以评估在文化感染的细胞的基因表达反应。微阵列平台各不相同，因此按照制造商的指示标记的探针杂交混合物的准备。
使用定制设计痘阵列1，我们可以分为“早”或“迟到”的基础上杂交信号的时间和病毒DNA的复制是否成绩单检测所需的一般分类的基因。我们观察到预期在每个颞类中的基因的功能类别（即，预计早期，中期和晚期基因）的转录的确切时间的变化。
在这项工作中利用该方法能够预测病毒的基因转录的早期或在复制周期的后期，但有更多的困难与早期和晚期启动子的基因，因为采用了双早/晚启动成绩单区分早期只可能坚持和检测到后期倍。此外，通过后期病毒基因的转录运行可能影响在一个给定的探头/阵列上的即期的信号，作为杂交到阵列的RNA可以从指定的ORF或上游的ORF来。平铺阵列曾试图解决这个问题，但挑战依然存在通过使用杂交2,3,4为基础的方法检测转录运行在。
主机转录模式，也可以使用这些方法进行评估。然而，牛痘编码多种机制抑制宿主反应，和主机转录反应可能会减少，比5,6,7,8等刺激。由于在参与宿主的防御许多基因的表达，感染后的改变，对抗宿主的免疫反应的病毒基因的贡献，因此考虑。
利用这些方法，可确定的所有病毒基因的转录时间图谱，并询问未知病毒基因的功能。此外，这些方法可以用来解剖病毒与宿主之间复杂的对话。这些方法被广泛适用于其他的宿主 - 病原体感染系统。如果感兴趣的病原体没有聚腺苷酸化的mRNA的，可供选择的方法可直接用于标签的总RNA，没有线性放大。通过在主机和同步感染病毒的基因表达分析，这些方法使我们能够获得的洞察力与宿主细胞环境，以及对病毒感染的主机反防御到病毒的相互作用。
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Acknowledgments
怀特黑德研究所的研究员基金
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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