Summary
쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.
Abstract
쿠매시 블리언트 블루 (CBB), 독성 및 인화성 유기 용제 (메탄올, 에탄올 또는 2 - 프로파놀)과 초산 높은 내용으로 솔루션을 사용하는 고전적인 단백질 얼룩 프로토콜에 얼룩 및 SDS 후 젤의 단백질 destaining, 고정에 사용됩니다 페이지. 짧은 시간 동안 전자렌지에 얼룩 솔루션을 가열, 절차를 속도를하는 것은 자주 사용됩니다. 독성 또는 유해 메탄올, 에탄올 또는 2 - 프로파놀 안전 고려 사항으로 인해 피해야한다 실험실에서 초산의 강한 냄새의 증발이 일반적으로 발생합니다. 원래 EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1))하여 두 특허 출원에 발표된 프로토콜에서 얼룩 솔루션의 대체 성분이 더 용매 유기 또는 산성이 사용되지하는에 설명되어 있습니다. CBB는 bidistilled 물속에 녹아있는 것입니다 (CBB G - 250 당 리터의 60 80mg) 35 MM HCL은 얼룩 솔루션에서 유일하게 다른 화합물로 추가됩니다. 젤의 CBB의 staning는 bidistilled 물에 젤의 SDS - PAGE와 철저한 세척 후에 이루어집니다. 세탁 중에 젤 가열 및 단계를 얼룩으로, 프로세스는 빨리 완료 될 수 있으며, 아무런 독성 또는 유해 compunds이 증발되지 않습니다. 단백질 얼룩이 솔루션을 얼룩에 젤 가열 후 일분 이내에 이미 발생하고 완전히 스테인드 단백질에 영향을주지 않고, bidistilled 물속에 스테인드 젤의 장기간 세척하여 완전히 destained하는 약간 파란색 배경과 15-30 분 후에 개발 밴드.
Protocol
1 부 : CBB의 얼룩 솔루션의 준비
- CBB의 60-80 MG는 G - 250은 2-4시간에 대한 감동으로 bidistilled 물 1리터에 녹아 있습니다. 마지막으로, 집중 HCL 3 ML은 다른 분간 교반과 함께 진한 파란색 솔루션에 추가하고 나중에 사용하기 위해 어둠에 저장됩니다. 이 솔루션은 그 얼룩의 효율성을 잃지 않고 몇 개월까지 주 동안 최대 저장할 수 있습니다.
- 집중 HCL은 퓸 후드에서 사용하는 일반적인 치료 깨물어으로 취급해야합니다. 최종 솔루션은 산도 약 2 있으므로 장갑을 사용해야하고 피부와의 접촉을 피해야한다에있을 것입니다.
2 부 : SDS - PAGE
- 단백질 시료의 적절한 aliquots는 1X 로딩 버퍼의 최종 농도 버퍼를 읽어와 혼합됩니다. 우리는 125mM Tris/H3PO4 (25 ° C에서 산도 7.5), 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4% SDS, 200mM DTT, 0.02 % bromophenol 파란색과 50 %의 글리세롤과 2X 로딩 버퍼를 사용합니다. SDS - PAGE 다른 로딩 버퍼 잘으로 사용할 수 있습니다.
- 단백질 샘플이 로딩되기 전에 약 5 분 가열합니다. 한편, 겔 전기 영동 챔버는 실행을위한 준비가되어 있습니다. 우리는 XCell SureLock에 © 비스 - 트리스 젤 (Invitrogen) ® MES - 버퍼와 미니 셀 (Invitrogen)가 실행 버퍼지만 다른 겔 및 전기 시스템뿐만 아니라 사용할 수있는 프리 캐스트 4-12%의 NuPAGE를 사용합니다.
- 단백질 샘플은 220V 50 분 실행 젤과 전기 영동에로드됩니다.
파트 3 : 젤의 스테 이닝
- 겔 카세트가 해체되고 젤은 이후 세정 단계를 상자에 배치됩니다.
- bidistilled 물을 약 100 ML은 겔에 추가하고 30 초 동안 전자 레인지에 가열합니다. 비등가 발생하기 전에 난방을 중단해야합니다. 젤있는 상자는 다음 3-5 분 쉐이크에 위치합니다. 이 세척 단계는 신선한 물로 두 번 반복됩니다.
- 충분 CBB의 얼룩 솔루션은 상자에 겔 10 초위한 전자 레인지에 가열 상자를 커버에 추가됩니다. 끓는없이. 젤있는 상자 후 얼룩을 마무리를위한 쉐이크에 위치합니다. 이미 일분 후, 단백질 밴드는 15-30 분 후 볼 수 있습니다. 얼룩은 대부분의 경우 충분히 강하.
- 얼룩 솔루션은 해제 붓고되고 50-100 ML bidistilled 물을 더 쉐이크에서 젤의 하늘색 배경을 destain하기 위해 추가됩니다. 물이 필요한 경우 추가 destaining 신선한 물로 교체하실 수 있습니다.
- 젤은 스캔한 사진이나 장기 보관을위한 건조 수 있습니다
4 부 : 대표 결과 :
그림을 참조하십시오. 설명 절차에 따라 제대로 스테인드 젤 1.
그림을 참조하십시오. 얼룩 및 잔류 SDS하기 전에 충분히 세탁되지 않은 젤에 대한 2 효율적으로 얼룩을 억제. 마커 차선은 (*) 마커 단백질 같은 금액을 포함합니다.
그림. 1 : 단백질 정제의 샘플 (분자량 마커 *)를 로딩 후 대표 겔 얼룩.
그림. 2 : CBB의 얼룩하기 전에 충분히 세탁되지 않은 CBB 스테인드 젤. 단백질 밴드가 (마커 레인 *이 그림에서와 같이 단백질의 같은 양의 1. 포함되어 있습니다) 약한 나타납니다.
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Discussion
- 세척 단계는 단백질의 효율적인 얼룩을 위해 중요하다. 2 분 또는 물 (<50ml)의 감소 볼륨 아래의 감소 세척 시간은 겔에 잔류 SDS 높은 금액으로 인한 가능성이 가장 높은 하늘색 단백질 밴드에 발생할 수 있습니다.
- 단백질은 질량 분광법으로 분석 될 경우, 전자 레인지에서 가열 단계는 생략한다, 10의 각 단계에서 분 및 밴드 강도까지 연장 얼룩 시간까지 확장 젤의 세탁 시간은 충분히 강하 . 질량 분석법에 의한 겔 매트릭스하기 때문에 단백질의 검출에 단백질의 crosslinking에서 젤 결과를 가열하는 것은 방해 수 있습니다.
- 대신 CBB G - 250, 한 Wondrak에서 원래 프로토콜에 따라 CBB R - 250을 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에 CBB G - 250의 재고를했고이 염료와 함께 좋은 결과를 것처럼 우리는 옆에 두 염료 측면을 비교하지 않았습니다.
- 프로 시저의 속도와 세정 얼룩 단계에서 독성 또는 유해 용제의 누락이 프로토콜을 사용하기위한 가장 중요하고 설득력 요소입니다. 감도는 고전적인 CBB의 얼룩 프로토콜과 상업 CBB의 얼룩 솔루션의 동일한 범위에 표현 및 재조합 단백질의 정화 분야에서 우리의 SDS - PAGE 분석을위한 제한 요인되지 않았습니다.
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Disclosures
아무 충돌 관심 없습니다. 절차 (참조을 참조하십시오.) 원래 EM Wondrak하여 특허 출원에 출판 되었음 : 위에서 설명한.
Acknowledgments
우리는 이네스 Racké의 기술 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | any other CBB G-250 could be used as well |
| Concentrated HCl |
References
- Process for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 6319720 (B1) (2001).
- Solution for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 2001046709 (A1) (2001).
