Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

Summary

En kort protokoll för protein färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 i polyakrylamidgeler beskrivs utan att använda organiska lösningsmedel eller ättiksyra som i den klassiska färgning förfaranden med CBB.

Abstract

I klassisk protokoll protein färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB), lösningar med höga halter av giftiga och brandfarliga organiska lösningsmedel (metanol, etanol eller 2-propanol) och ättiksyra används för fixering, färgning och avfärgning av proteiner i en gel efter SDS -PAGE. För att påskynda förfarandet, värme färglösningen i mikrovågsugn en kort tid används ofta. Detta resulterar vanligen i avdunstning av giftiga eller farliga metanol, etanol eller 2-propanol och en stark lukt av ättiksyra i labbet som bör undvikas av säkerhetsskäl. I ett protokoll publicerades ursprungligen i två patentansökningar av EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), är ett alternativ sammansättning färglösningen beskrivs där inga organiska lösningsmedel eller syra används. Den CBB löses upp i bidistilled vatten (60-80mg av CBB G-250 per liter) och 35 mM HCl läggs till som den enda förening i färglösningen. Den CBB staning av gelen görs efter SDS-PAGE och grundlig tvättning av gel i bidistilled vatten. Genom uppvärmning av gelen under tvätt och färgning steg kan processen vara klar snabbare och inga giftiga eller farliga föreningar som avdunstar. Den färgning av proteinerna sker redan inom 1 minut efter uppvärmning gelen i färglösningen och är fullt utvecklad efter 15-30 minuter med en lätt blå bakgrund som destained helt av långvarig tvätt av färgade gel i bidistilled vatten, utan att påverka färgade proteinet band.

Protocol

Del 1: Beredning av CBB färglösning

1. 60-80 mg CBB G-250 löses upp i 1 liter bidistilled vatten under omrörning i 2-4 timmar. Slutligen är 3 ml koncentrerad HCl tillsätts den mörkblå lösning med omrörning i ytterligare en minut och förvaras mörkt för senare användning. Lösningen kan lagras i veckor upp till flera månader utan att förlora sin färgning effektivitet.
2. Koncentrerad HCl bör hanteras med den vanliga vården und används under ett dragskåp. Den slutliga lösningen kommer att vara ca pH 2, så handskar bör användas vara och någon kontakt med huden bör undvikas.

Del 2: SDS-PAGE

1. Lämpliga portioner av protein prover blandas med buffert till en slutlig koncentration av 1x buffert. Vi använder 2x buffert med 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 vid 25 ° C), 2mm EDTA, 4% SDS, 200mm DTT, 0,02% Bromfenolblått och 50% glycerol. Övrigt lastning buffertar för SDS-PAGE kan användas också.
2. Protein prov värms i ca 5 minuter före lastning. Samtidigt är gelelektrofores kammare förberedd för loppet. Vi använder prefabricerade 4-12% NuPAGE © Bis-Tris geler (Invitrogen) i en XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) med MES-buffert som löpande buffert, men någon annan gel och elektrofores systemet kan användas också.
3. Protein prover laddades på gelen och elektrofores köra i 50 minuter vid 220V.

Del 3: färgning av gelen

1. Gelen kassetten demonteras och gelen placeras i en låda för de efterföljande tvätt stegen.
2. Ca 100 ml bidistilled vatten läggs till gelen och värms i mikrovågsugnen i 30 sekunder. Uppvärmning bör stoppas innan kokning inträffar. Lådan med gel placeras sedan på en shaker i 3-5 min. och detta tvättsteg upprepas två gånger med färskt vatten.
3. Nog CBB färgning tillsätts för att täcka gelen i rutan och rutan värms i mikron i 10 sek. utan kokning. Lådan med gel placeras sedan på en shaker för slutbehandling av färgning. Redan efter 1 minut, kan protein band observeras efter 15-30 min. färgningen är stark nog i de flesta fall.
4. Färglösningen hälls av och 50-100 ml bidistilled vatten tillsätts för att ytterligare Avfärga den ljusblå bakgrund av gelen på en shaker. Vattnet kan ersättas med friskt vatten för ytterligare avfärgning om det behövs.
5. Gelen kan skannas, fotograferas eller torkade för långtidsförvaring

Del 4: representativa resultat:

Se figur. 1 för en korrekt färgad gel efter den beskrivna metoden.

Se figur. 2 för en gel som inte har tvättats så pass långt före färgning och restprodukter SDS hämmar effektiv färgning. Observera att markören körfält (*) innehåller samma mängd markör proteiner.

Fig.. 1: Representativa gel färgade Efter att proverna av ett protein rening (*: molekylviktsmarkör).

Fig.. 2: CBB färgade gel som inte har tvättats tillräckligt länge innan CBB färgning. Proteinet band visas svagare (observera att markören körfält * innehåller samma mängd protein som i figur. 1).

Discussion

• Tvätten steg är avgörande för en effektiv färgning av proteinerna. En minskad tvättid under 2 minuter eller minskad mängd vatten (<50 ml) kan resultera i ljusblått protein band, sannolikt på grund av större mängder kvarvarande SDS i gelen.
• Om de proteiner kommer att analyseras med masspektrometri, ska värmen steg i mikrovågsugn ska hoppas över, är det dags för tvätt av gelen förlängas till ca 10 min i varje steg och färgningen tiden förlängs till bandet intensiteten tillräckligt stark . Värme gelen resulterar i crosslinking av proteiner till gelmatrisen och därmed upptäckt av de proteiner med masspektrometri kan hindras.
• Istället för CBB G-250, kan man använda CBB R-250 enligt den ursprungliga protokollet genom Wondrak. Vi har inte jämföras både färgämnen sida vid sida som vi hade ett lager av CBB G-250 i vårt labb och hade goda resultat med denna färg.
• Hastigheten i förfarandet och utelämnandet av giftiga eller farliga lösningsmedel i tvätt och färgning stegen är de viktigaste och mest övertygande faktorer för att använda detta protokoll. Känsligheten är i samma utbud av klassiska CBB färgning protokoll och kommersiella CBB lösningar färgning och har inte varit en begränsande faktor för vår SDS-PAGE analys när det gäller uttryck och rening av rekombinanta proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl