Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Summary

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Abstract

In de klassieke eiwitkleuring protocollen met behulp van Coomassie Brilliant Blue (CBB), oplossingen met een hoog gehalte aan giftige en brandbare organische oplosmiddelen (methanol, ethanol of 2-propanol) en azijnzuur worden gebruikt voor fixatie, kleuren en ontkleuren van eiwitten in een gel na SDS -PAGE. Het versnellen van de procedure, het verwarmen van de kleuroplossing in de magnetron voor een korte tijd wordt vaak gebruikt. Dit resulteert meestal in verdamping van giftige of gevaarlijke methanol, ethanol of 2-propanol en een sterke geur van azijnzuur in het lab die moeten worden vermeden vanwege de veiligheid overwegingen. In een protocol oorspronkelijk gepubliceerd in twee octrooiaanvragen door EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), is een alternatieve samenstelling van de kleuroplossing beschreven waarin geen organische oplosmiddelen of zuur wordt gebruikt. Het CBB is opgelost in dubbelgedestilleerd water (60-80 mg van het CBB G-250 per liter) en 35 mM HCl wordt toegevoegd als de enige andere verbinding in de kleuroplossing. Het CBB staning van de gel gebeurt na SDS-PAGE en grondig wassen van de gel in dubbelgedestilleerd water. Door het verwarmen van de gel tijdens het wassen en vlekken stappen, kan het proces sneller worden afgewerkt en er geen giftige of gevaarlijke compunds worden verdampen. De kleuring van eiwitten gebeurt al binnen 1 minuut na het verwarmen van de gel in kleuroplossing en is volledig ontwikkeld na 15-30 minuten met een licht blauwe achtergrond die volledig ontkleurd bij langdurige wassen van de gekleurde gel in dubbelgedestilleerd water, zonder dat de lood-eiwit bands.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van de CBB kleuroplossing

1. 60-80 mg van het CBB G-250 worden opgelost in 1 liter dubbelgedestilleerd water door roeren gedurende 2-4 uur. Tot slot, is 3 ml geconcentreerd HCl toegevoegd aan de donkerblauwe oplossing onder roeren nog een minuut en in het donker bewaard voor later gebruik. De oplossing kan worden opgeslagen voor weken tot enkele maanden zonder verlies van de vlekken efficiëntie.
2. Geconcentreerde HCl moeten worden behandeld met de gebruikelijke zorg und gebruikt onder een zuurkast. De uiteindelijke oplossing wordt bij ongeveer pH 2, dus handschoenen moeten worden gebruikt en elk contact met de huid moet worden vermeden.

Deel 2: SDS-PAGE

1. Juiste hoeveelheden van eiwit monsters worden gemengd met het laden van buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 x laadbuffer. We maken gebruik van 2x laadbuffer met 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 bij 25 ° C), 2 mM EDTA, 4% SDS, 200mm DTT, 0,02% broomfenolblauw en 50% glycerol. Overige laad-buffers voor SDS-PAGE kan worden gebruikt.
2. Eiwit monsters worden verhit gedurende ongeveer 5 minuten voor het laden. Ondertussen wordt de gel electroforese kamer klaar voor de run. We maken gebruik van prefab 4-12% NuPAGE © Bis-Tris gels (Invitrogen) in een XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) met MES-buffer als de lopende buffer, maar een andere gel en electroforese systeem kan worden gebruikt.
3. Eiwit monsters worden geladen op de gel en electroforese lopen gedurende 50 min bij 220V.

Deel 3: kleuring van het gel

1. De gel cassette is gedemonteerd en de gel geplaatst in een doos voor de volgende wasstappen.
2. Ongeveer 100 ml dubbelgedestilleerd water wordt toegevoegd aan de gel en verwarmd in de magnetron gedurende 30 seconden. De verwarming moet worden gestopt voordat koken optreedt. De doos met de gel wordt vervolgens geplaatst op een shaker voor 3-5 minuten. en dit wasstap wordt tweemaal herhaald met vers water.
3. Genoeg CBB kleuroplossing wordt toegevoegd aan de gel in de doos en de doos opgewarmd in de magnetron voor 10 sec te dekken. zonder te koken. De doos met de gel wordt vervolgens geplaatst op een shaker voor het afwerken van de kleuring. Reeds na 1 minuut, kan eiwitbanden worden waargenomen, na 15-30 minuten. de kleuring sterk genoeg is in de meeste gevallen.
4. De kleuroplossing wordt afgegoten en 50-100 ml dubbelgedestilleerd water wordt toegevoegd om verder destain de lichtblauwe achtergrond van de gel op een shaker. Het water kan worden vervangen door vers water voor de verdere ontkleuren wordt indien nodig.
5. De gel kan worden gescand, gefotografeerd of gedroogd voor langdurige opslag

Deel 4: representatieve resultaten:

Zie Fig. 1 voor een goed gekleurde gel volgens de beschreven procedure.

Zie Fig. 2 voor een gel die niet is lang genoeg gewassen voor de kleuring en resterende SDS remt efficiënt vlekken. Merk op dat de marker rijstroken (*) dezelfde hoeveelheid van merker eiwitten bevatten.

Fig. 1: Representatieve gel gekleurd na het laden monsters van een eiwit zuivering (*: moleculair gewicht marker).

Fig. 2: CBB gekleurde gel die niet lang genoeg gewassen voor CBB vlekken. Het eiwit bands verschijnen zwakker (merk op dat de marker rijstrook * evenveel eiwit als in Fig. 1 bevat).

Discussion

• Het wassen stappen zijn cruciaal voor de efficiënte kleuren van de eiwitten. Een verminderde wastijd minder dan 2 min of verminderd volume van het water (<50 ml) kan resulteren in een lichtblauw eiwitbanden, waarschijnlijk als gevolg van hogere hoeveelheden van de resterende SDS in de gel.
• Als de eiwitten zullen worden geanalyseerd door massaspectrometrie, de verwarming stappen in de magnetron moet worden overgeslagen, is de tijd voor het wassen van de gel uitgebreid tot ongeveer 10 min in elke stap en de kleuring tijd verlengd tot de band intensiteit sterk genoeg is . Verwarmen van de gel resulteert in een verknoping van eiwitten aan de gel matrix en dus de detectie van de eiwitten met behulp van massaspectrometrie kunnen worden belemmerd.
• In plaats van het CBB G-250, kan men gebruik maken van CBB R-250 volgens het oorspronkelijke protocol door Wondrak. We hebben niet ten opzichte van zowel kleurstoffen naast elkaar want we hadden een voorraad van CBB G-250 in ons lab en had goede resultaten met deze kleurstof.
• De snelheid van de procedure en het weglaten van giftige of gevaarlijke oplosmiddelen in het wassen en vlekken stappen zijn de belangrijkste en meest overtuigende factoren voor het gebruik van dit protocol. De gevoeligheid is in dezelfde range van de klassieke CBB vlekken protocollen en commerciële CBB vlekken oplossingen en is niet een beperkende factor voor onze SDS-PAGE-analyse op het gebied van expressie en zuivering van recombinante eiwitten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl