Summary
Coomassie खूब (CBB) ब्लू polyacrylamide जैल में G-250 के साथ प्रोटीन धुंधला के लिए एक छोटी प्रोटोकॉल CBB के साथ शास्त्रीय धुंधला प्रक्रियाओं के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स या एसिटिक एसिड का उपयोग कर के बिना वर्णित है.
Abstract
शास्त्रीय प्रोटीन धुंधला Coomassie खूब (CBB) ब्लू, विषैले और ज्वलनशील कार्बनिक (मेथनॉल, इथेनॉल, या 2-propanol) और सॉल्वैंट्स एसिटिक एसिड के उच्च सामग्री के साथ समाधान का उपयोग प्रोटोकॉल के निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है, धुंधला हो जाना और प्रोटीन की एक जेल में एसडीएस बाद destaining - PAGE. प्रक्रिया को गति, एक कम समय के लिए माइक्रोवेव ओवन में धुंधला समाधान हीटिंग के लिए अक्सर इस्तेमाल किया है. यह विषाक्त या खतरनाक मेथनॉल, इथेनॉल या 2-propanol और जो सुरक्षा कारणों की वजह से बचा जाना चाहिए प्रयोगशाला में एसिटिक एसिड के मजबूत गंध के वाष्पीकरण में आमतौर पर परिणाम. एक प्रोटोकॉल मूल EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) द्वारा दो पेटेंट आवेदनों में प्रकाशित में, धुंधला समाधान के एक वैकल्पिक संरचना का वर्णन है जिसमें कोई विलायक कार्बनिक अम्ल या प्रयोग किया जाता है. CBB bidistilled पानी में भंग कर रहा है (60-CBB जी 250 प्रति लीटर के 80mg) और 35 मिमी एचसीएल केवल धुंधला समाधान में अन्य यौगिक के रूप में जोड़ा जाता है. जेल के CBB staning bidistilled पानी में जेल की एसडीएस पृष्ठ और पूरी तरह से धोने के बाद किया जाता है. धोने के दौरान जेल हीटिंग और कदम धुंधला करके इस प्रक्रिया को तेजी से समाप्त किया जा सकता है और कोई विषाक्त या खतरनाक compunds evaporating हैं. प्रोटीन का धुंधला 1 मिनट के भीतर पहले से ही समाधान धुंधला में जेल हीटिंग के बाद होता है और एक थोड़ा नीले रंग की पृष्ठभूमि है कि पूरी तरह से bidistilled पानी में दाग जेल के लंबे समय तक धोने के द्वारा destained है के साथ 15-30 मिनट के बाद पूरी तरह से सना हुआ प्रोटीन को प्रभावित किए बिना, विकसित बैंड.
Protocol
भाग 1: CBB धुंधला समाधान की तैयारी
- CBB के 60-80 मिलीग्राम G-250 bidistilled पानी की 1 लीटर में 2-4 घंटे के लिए सरगर्मी से भंग कर रहे हैं. अंत में, ध्यान केंद्रित एचसीएल के 3 मिलीलीटर एक मिनट के लिए सरगर्मी के साथ गहरे नीले समाधान के लिए जोड़ा जाता है और बाद में उपयोग के लिए अंधेरे में संग्रहीत. समाधान सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है इसके धुंधला दक्षता को खोने के बिना कई महीनों के लिए.
- केंद्रित एचसीएल सामान्य देखभाल एक धूआं हुड के तहत इस्तेमाल किया und के साथ संभाला जाना चाहिए. अंतिम समाधान पीएच 2 के बारे में है, तो दस्ताने और इस्तेमाल किया जा चाहिए त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचा जाना चाहिए किया जाएगा.
भाग 2: एसडीएस पृष्ठ
- प्रोटीन के नमूने के उपयुक्त aliquots 1x लोड हो रहा है बफर के अंतिम एकाग्रता के लिए बफर लोड हो रहा है के साथ मिश्रित कर रहे हैं. हम 125mm Tris/H3PO4 (25 डिग्री सेल्सियस पर 7.5 पीएच) 2mm EDTA, 4% एसडीएस, 200mm डीटीटी, 0.02% bromophenol नीले और 50% ग्लिसरॉल के साथ 2x लोड हो रहा है बफर का उपयोग करें. एसडीएस पृष्ठ के लिए अन्य लोडिंग buffers के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रोटीन के नमूने लोड करने से पहले के बारे में 5 मिनट के लिए गरम कर रहे हैं. इस बीच, जेल वैद्युतकणसंचलन चैम्बर चलाने के लिए तैयार है. हम मिल में बना हुआ 4-12% NuPAGE का उपयोग © बीआईएस Tris (Invitrogen) के एक XCell SureLock में जैल ® एमईएस - बफर के साथ मिनी सेल (Invitrogen) के रूप में अच्छी तरह से चल रहा है बफर लेकिन किसी अन्य जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रोटीन के नमूने जेल वैद्युतकणसंचलन और 220V पर 50 मिनट के लिए चलाने पर लोड कर रहे हैं.
भाग 3: जेल के धुंधला
- जेल कैसेट और disassembled जेल बाद धोने कदम के लिए एक बॉक्स में रखा गया है.
- Bidistilled पानी की 100 मिलीलीटर जेल करने के लिए जोड़ा जाता है और 30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव ओवन में गर्म. ताप पहले उबलते होता है रोका जाना चाहिए. जेल के साथ बॉक्स तो 3-5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखा. और इस धोने कदम ताजे पानी के साथ दो बार दोहराया है.
- बस CBB धुंधला समाधान बॉक्स में जेल और 10 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में गर्म बॉक्स को कवर करने के लिए जोड़ा जाता है. उबलते के बिना. जेल के साथ बॉक्स तो धुंधला परिष्करण के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखा. 1 मिनट के बाद पहले से ही, प्रोटीन बैंड 15-30 मिनट के बाद हो सकता है, देखा जा. धुंधला ज्यादातर मामलों में काफी मजबूत है.
- धुंधला समाधान से डाला है और 50-100 मिलीलीटर bidistilled पानी के क्रम में जोड़ा जाता है आगे एक प्रकार के बरतन पर जेल के हल्के नीले रंग की पृष्ठभूमि destain. पानी आगे destaining अगर जरूरत के लिए ताजा पानी से प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
- जेल, स्कैन किया जा सकता है फोटो खिंचवाने या लंबी अवधि के भंडारण के लिए सूखे
भाग 4: प्रतिनिधि परिणाम:
चित्र देखें. एक ठीक से दाग वर्णित प्रक्रिया के बाद जेल के लिए 1.
चित्र देखें. एक जेल है कि काफी लंबे समय से पहले धुंधला हो जाना और अवशिष्ट एसडीएस धोया नहीं किया गया है के लिए 2 कुशल धुंधला रोकता. ध्यान दें कि मार्कर गलियों (*) मार्कर प्रोटीन का एक ही राशि में होते हैं.
चित्र 1: एक प्रोटीन शुद्धीकरण के नमूने (आणविक भार मार्कर *) लोड हो रहा है के बाद प्रतिनिधि जेल दाग.
चित्र 2: CBB दाग जेल है कि काफी लंबे समय के CBB धुंधला पहले धोया नहीं किया गया है . प्रोटीन बैंड कमजोर दिखाई देते हैं (कृपया ध्यान दें कि मार्कर लेन * प्रोटीन का एक ही राशि के रूप में छवि में 1. शामिल).
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Discussion
- धोने कदम प्रोटीन के कुशल धुंधला के लिए महत्वपूर्ण हैं. 2 मिनट या पानी (50ml <) की कम मात्रा के नीचे एक कम समय धोने पीली नीली प्रोटीन बैंड, सबसे अधिक संभावना जेल में उच्च अवशिष्ट एसडीएस की मात्रा के कारण में परिणाम कर सकते हैं.
- यदि प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री से विश्लेषण किया जा रहे हैं, माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग कदम छोड़ जाना चाहिए, प्रत्येक चरण में 10 मिनट के बारे में और धुंधला बैंड तीव्रता तक बढ़ाया समय के लिए बढ़ाया जेल की धोने के लिए समय काफी मजबूत है . जेल मैट्रिक्स और इस प्रकार प्रोटीन का पता लगाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री से प्रोटीन की crosslinking में जेल परिणाम ताप बाधा जा सकता है.
- CBB G-250 के बजाय, एक CBB आर 250 Wondrak द्वारा मूल प्रोटोकॉल के अनुसार उपयोग कर सकते हैं. हम पक्ष द्वारा दोनों रंजक पक्ष तुलना नहीं है के रूप में हम अपनी प्रयोगशाला में जी 250-CBB के एक शेयर की थी और इस रंग के साथ अच्छे परिणाम था.
- प्रक्रिया की गति और धोने और धुंधला चरणों में विषाक्त या खतरनाक सॉल्वैंट्स की चूक इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण और ठोस कारक हैं. संवेदनशीलता शास्त्रीय CBB धुंधला प्रोटोकॉल और वाणिज्यिक CBB धुंधला समाधान की एक ही श्रेणी में है और हमारी अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि के क्षेत्र में एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक सीमित कारक नहीं किया गया है.
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Disclosures
कोई परस्पर विरोधी हितों. प्रक्रिया ऊपर वर्णित किया गया था मूल रूप से EM Wondrak द्वारा एक पेटेंट आवेदन में प्रकाशित (रेफरी देख.).
Acknowledgments
हम Ines Racké की तकनीकी सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | any other CBB G-250 could be used as well |
| Concentrated HCl |
References
- Process for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 6319720 (B1) (2001).
- Solution for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 2001046709 (A1) (2001).
