Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Summary

Ein kurzes Protokoll für Protein-Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in Polyacrylamidgelen wird ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Essigsäure als in der klassischen Färbeverfahren mit CBB beschrieben.

Abstract

In der klassischen Protein Färbeprotokollen mit Coomassie Brilliant Blue (CBB), Lösungen mit hohen Gehalten von toxischen und brennbaren organischen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol oder 2-Propanol) und Essigsäure sind zur Fixierung verwendet, Färben und Entfärben von Proteinen in einem Gel nach SDS -PAGE. Zur Beschleunigung der Verfahren, Erhitzen der Färbelösung in der Mikrowelle für eine kurze Zeit wird häufig verwendet. Dies führt in der Regel Verdampfung von giftigen oder gefährlichen Methanol, Ethanol oder 2-Propanol und ein starker Geruch von Essigsäure im Labor, die vermieden aus Sicherheitserwägungen sollte. In einem Protokoll ursprünglich in zwei Patentanmeldungen EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) veröffentlicht wurde, ist eine alternative Zusammensetzung der Färbelösung beschrieben, in denen keine organischen Lösungsmittel oder Säuren verwendet wird. Die CBB ist in bidestilliertem Wasser gelöst (60-80mg CBB G-250 pro Liter) und 35 mM HCl ist als einzige weitere Verbindung in die Färbelösung aufgenommen. Die CBB Staning des Gels wird nach SDS-PAGE und gründliches Waschen des Gels in bidestilliertem Wasser getan. Durch Erhitzen des Gels während des Waschens und Färbeschritte, kann der Prozess schneller beendet sein und keine giftigen oder gefährlichen Kombinationspräparate sind verdampft. Die Färbung von Proteinen tritt bereits innerhalb von 1 Minute nach dem Erwärmen des Gels in Färbelösung und ist voll nach 15-30 min mit einem leicht blauen Hintergrund, die komplett bei längerer Waschen der gefärbten Gel in bidestilliertem Wasser entfärbt entwickelt, ohne dass die gefärbten Proteins Bands.

Protocol

Teil 1: Vorbereitung der CBB Färbelösung

1. 60-80 mg der CBB G-250 werden in 1 Liter bidestilliertem Wasser unter Rühren für 2-4 Stunden gelöst. Schließlich wird mit 3 ml konzentrierter HCl auf den dunkelblauen Lösung unter Rühren für eine weitere Minute hinzugefügt und im Dunkeln aufbewahrt für eine spätere Verwendung. Die Lösung kann für mehrere Wochen aufbewahrt werden bis zu mehreren Monaten, ohne seine Färbung Effizienz.
2. Konzentrierte HCl sollte mit der üblichen Sorgfalt und unter einer Abzugshaube verwendet gehandhabt werden. Die endgültige Lösung wird auf ca. pH 2, so sollten Handschuhe benutzt werden und jede Berührung mit der Haut sollte vermieden werden.

Teil 2: SDS-PAGE

1. Entsprechende Aliquots der Protein-Proben werden mit Ladepuffer auf eine Endkonzentration von 1x Ladepuffer gemischt. Wir verwenden 2x Ladepuffer mit 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 bei 25 ° C), 2 mM EDTA, 4% SDS, 200 mM DTT, 0,02% Bromphenolblau und 50% Glycerin. Weitere Lade-Puffer für SDS-PAGE können ebenso verwendet werden.
2. Protein-Proben werden für ca. 5 min vor dem Laden erwärmt. Inzwischen ist der Gel-Elektrophorese Kammer für den Lauf vorbereitet. Wir verwenden vorgefertigte 4-12% NuPAGE © Bis-Tris Gele (Invitrogen) in einer XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) mit MES-Puffer als Laufpuffer aber jede andere Gels und Elektrophorese-System kann ebenso verwendet werden.
3. Protein-Proben auf das Gel und Elektrophorese für 50 min bei 220 V laufen geladen.

Teil 3: Die Färbung des Gels

1. Das Gel Kassette wird demontiert und das Gel in ein Feld für die nachfolgenden Waschschritte platziert.
2. Etwa 100 ml zweifach destilliertem Wasser wird das Gel hinzu und erhitzt in der Mikrowelle für 30 Sekunden. Heizung sollte gestoppt werden, bevor Sieden auftritt. Die Box mit dem Gel wird dann auf einem Schüttler für 3-5 min gegeben. und dieser Waschschritt wird zweimal mit frischem Wasser wiederholt.
3. Genug CBB Färbelösung wird hinzugefügt, um das Gel in die Box und das Feld in der Mikrowelle für 10 Sekunden erhitzt decken. ohne zu kochen. Die Box mit dem Gel wird dann auf einem Schüttler zur Fertigstellung der Färbung gelegt. Bereits nach 1 Minute, können Proteinbanden beobachtet, nach 15-30 min. die Färbung ist stark genug, in den meisten Fällen.
4. Die Färbelösung wird abgegossen und 50-100 ml zweifach destilliertem Wasser wird zugesetzt, um weitere Entfärbung der hellblauen Hintergrund des Gels auf einem Schüttler. Das Wasser kann durch frisches Wasser für die weitere Entfärbung bei Bedarf ersetzt werden.
5. Das Gel kann gescannt, fotografiert zu werden oder getrocknet für die langfristige Lagerung

Teil 4: Repräsentative Ergebnisse:

Siehe Abb.. 1 für eine richtig gefärbten Gel nach dem beschriebenen Verfahren.

Siehe Abb.. 2 für ein Gel, das nicht schon lange genug vor der Färbung und Rest-SDS gewaschen hemmt effizienten Färbung. Beachten Sie, dass der Marker Gassen (*) die gleiche Menge an Marker-Proteine ​​enthalten.

Abb.. 1: Vertreter Gel gefärbt nach dem Laden der Proben einer Proteinreinigung (*: Molekulargewichtsmarker).

Abb.. 2: CBB gefärbten Gel, das nicht schon lange genug vor dem CBB-Färbung gewaschen. Die Proteinbanden erscheinen schwächer (beachten Sie, dass der Marker Spur * die gleiche Menge an Protein, wie in Abb.. 1 enthält).

Discussion

• Die Waschschritte sind entscheidend für die effiziente Färbung der Proteine. Eine reduzierte Waschzeit unter 2 min oder reduziertem Volumen von Wasser (<50 ml) kann in hellblauen Proteinbanden, wahrscheinlich aufgrund der höheren Mengen an restlichem SDS im Gel führen.
• Wenn die Proteine ​​gehen, um durch Massenspektrometrie analysiert werden, die Heizung Schritte in der Mikrowelle übersprungen werden soll, ist die Zeit für das Waschen des Gels erweitert, um ca. 10 min in jedem Schritt und die Färbung der Zeit, bis die Band Intensität verlängert stark genug . Erhitzen des Gels führt zur Vernetzung der Proteine, die Gel-Matrix und damit Detektion der Proteine ​​mittels Massenspektrometrie könnte behindert werden.
• Anstelle von CBB G-250, kann man CBB R-250 nach dem Original-Protokoll von Wondrak verwenden. Wir haben nicht beide Farbstoffe nebeneinander verglichen, wie wir einen Bestand von CBB G-250 war in unserem Labor und hatte gute Ergebnisse mit diesem Farbstoff.
• Die Schnelligkeit des Verfahrens und der Verzicht auf giftige oder gefährliche Lösungsmittel in der Wasch-und Färbeschritte sind die wichtigsten und überzeugende Faktoren für dieses Protokoll verwenden. Die Empfindlichkeit ist im gleichen Bereich der klassischen CBB Färbeprotokollen und kommerziellen CBB Färbelösungen und wurde nicht ein limitierender Faktor für unsere SDS-PAGE-Analyse auf dem Gebiet der Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl