이 비디오 기사는 양질의 형광을 달성하기 위해 정액 샘플을 처리하는 방법을 단계적으로, 설명 현장에서 하이브 리다이 제이션. 얻은 준비는 임상 진단의 맥락에서 aneuploidy 심사 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Aneuploidies은 인간에서 가장 자주 염색체 이상입니다. 이러한 이상의 대부분은 부모의 gametogenic 과정 meiotic 오류로 인한. 인간의 남성에서 이러한 오류가 자손에게 이러한 이례적인 전송의 증가 위험을 나타내는 수치 염색체 이상과 마리의 정자 수야의 생산으로 이어질 수 있습니다.
이러한 이유로, 정자의 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 기술은 광범위하게 임상 진단의 맥락에 통합 프로토콜되고있다. 이러한 행위는 유전자의 생식 조언을 추구 환자의 gametes의 수치 염색체 이상의 주파수의 예측을 제공합니다.
지금까지 대부분의 자주 정자 생선 분석에 포함된 염색체는 염색체 X, Y, 13, 18과 21입니다.
이 비디오 문서에서는 어떻게 현미경의 결과를 시각화하는 방법에 정자 물고기 준비를 얻기 위해 진행 정자 염색질을 decondense 및 변성하는 방법, 인간의 정액 샘플을 처리하고 해결하는 방법을 단계적으로, 그리고 설명합니다. 가장 관련성이 높은 단계의 특별 연설은 최상의 결과를 달성하기 위해 주어집니다.
프로토콜
I. 샘플 처리 및 세포 고정
- 액화까지 20 분 실온에서 멸균 용기에 정액 샘플을 둡니다.
- 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 5 분 1천그램에 그것을 돌린다.
- 부드럽게 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 제거하고 폐기.
- hypotonic 솔루션을 추가 (KCl, 0.075M) 미리 가열 10 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안, 37 ° C 드롭에 의해 드롭.
- 37 물 목욕에 튜브를 삽입 ° C를 30 분.
- 5 분 1천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고, decantation로 뜨는 폐기하십시오.
- 8 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안 드롭하여 드롭 : 펠렛을 resuspending 후, 갓 Carnoy의 정착액을 (초산 3시 1분 메탄올) 준비 추가할 수 있습니다.
- 흰색 펠렛을 얻기 위해 필요한만큼 여러 번 같은 점 6과 7을 반복합니다.
- 신선한 메탄올 추가 : 초산 (3시 1분) (작은 펠릿 분들의 경우 확산 좋은 세포를 얻는 데 필요한 세포 농도 최종 음량을 조절하기 위해 드롭하여 드롭을 몇 방울이 높은 양의 샘플 반면에 충분합니다 정자가 회복의 최종 볼륨) 1-....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 정자 물고기 준비를위한 인간의 정액 샘플을 처리하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 남성의 염색체 이상 gametes를 분석하는 것이 가능합니다. 마리의 정자 수야 aneuploidy 심사는 기초 연구의 맥락과 불임 남성에게 주어진 생식 조언에 두 응용 프로그램이 있습니다. 임상 진단에 가장 널리 연구 염색체는 X, Y, 13, 18 및 21 염색체와 loci 광범위한 다른 상용 프로브은 사용할 수 있으며, 이러한 실험에서도 사용할 수 있지만.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 Generalitat 드 Catalunya (2005 - SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 그들의 자신의 기술 지원에 대한 감독과 격려, 그리고 J. 루카스에 대한 J. 블랑코와 F. 비달에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-디티오트레이톨 (DTT) | 재료 | 로슈 그룹 | 10197777001 | |
| 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올 | 재료 | 로슈 그룹 | 10708976001 | |
| 아세트산 | 재료 | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® 다색 DNA 프로브 키트
| 재료 | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| 원심분리기 5804R | 도구 | Eppendorf | ||
| 원심분리관 | 재료 | Nalge Nunc international | 347856 | |
| 코플린 자(유리제) | 재료 | 바로우월드 사이언티픽 | Hellendahl (ZCT278) | |
| 코플린 자(플라스틱) | 재료 | Deltalab | 191087 | |
| 커버슬립 (15x15) | 재료 | 크니틀 글레이저 | 4600115 | |
| 커버 슬립 (18x18) | 재료 | 니텔 글라저 | 4600118 | |
| 다이아몬드 펜슬 | 재료 | 하마허(Hammacher) | 335117010 | |
| 에탄올 | 재료 | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| 포름아미드 | 재료 | 로슈 그룹(Roche Group) | 11814320001 | |
| 냉동고 | 도구 | Zanussi | ||
| 장갑 | 재료 | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | 도구 | Vysis Inc. | ||
| 침강유 (Immersion Oil) | 재료 | Olympus Corporation | 35505 | |
| 배양기 | 도구 | Heraeus Instruments | ||
| 메탄올 | 재료 | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| 마이크로피펫 | 재료 | 실험실 시스템 | 핀피펫 (4500000) | |
| 마이크로피펫 팁 교체 | 재료 | Daslab | 16-2001 | |
| 매니큐어 | 재료 | 쿼-코스메틱스(Quo-cosmetics) | ||
| Olympus BX60 형광 현미경 | 도구 | Olympus Corporation | DAPI/Texas Red/FITC용 3색 필터와 Aqua, FITC 및 Texas Red용 단색 필터가 장착되어 있습니다. | |
| 파스퇴르 피펫 | 재료 | Rubilabor | 211.0230 | |
| 위상차 현미경 | 도구 | Nikon 기기 | ||
| 플라스틱 피펫 (3ml) | 재료 | Deltalab | 200007 | |
| 염화칼륨 (KCl) | 재료 | Fluka | 60128 | |
| 러버 시멘트 | 재료 | 최적 테스트 | ||
| 슬라이드 | 재료 | 크니텔 글레이저(Knittel Glaser) | 4520022 | |
| 슬라이드 보관함 | 재료 | Deltalab | 19276.1 | |
| 멸균 용기 | 재료 | Deltalab | 409726 | |
| 주사기 | 재료 | PentaFerte | 002022300 | |
| 온도계 | 재료 | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| 3회 증류수 | 재료 | |||
| Triton X-100 | 재료 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 핀셋 | 재료 | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| 수직 층류 <전자현미경>클린벤치 | 도구 | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| 볼텍스 믹서 | 도구 | Fisher Scientific | FB15012 | |
| 항온수조 | 도구 | Raypa® |
참고문헌
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
