Summary
이 비디오 기사는 양질의 형광을 달성하기 위해 정액 샘플을 처리하는 방법을 단계적으로, 설명
Abstract
Aneuploidies은 인간에서 가장 자주 염색체 이상입니다. 이러한 이상의 대부분은 부모의 gametogenic 과정 meiotic 오류로 인한. 인간의 남성에서 이러한 오류가 자손에게 이러한 이례적인 전송의 증가 위험을 나타내는 수치 염색체 이상과 마리의 정자 수야의 생산으로 이어질 수 있습니다.
이러한 이유로, 정자의 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 기술은 광범위하게 임상 진단의 맥락에 통합 프로토콜되고있다. 이러한 행위는 유전자의 생식 조언을 추구 환자의 gametes의 수치 염색체 이상의 주파수의 예측을 제공합니다.
지금까지 대부분의 자주 정자 생선 분석에 포함된 염색체는 염색체 X, Y, 13, 18과 21입니다.
이 비디오 문서에서는 어떻게 현미경의 결과를 시각화하는 방법에 정자 물고기 준비를 얻기 위해 진행 정자 염색질을 decondense 및 변성하는 방법, 인간의 정액 샘플을 처리하고 해결하는 방법을 단계적으로, 그리고 설명합니다. 가장 관련성이 높은 단계의 특별 연설은 최상의 결과를 달성하기 위해 주어집니다.
Protocol
I. 샘플 처리 및 세포 고정
- 액화까지 20 분 실온에서 멸균 용기에 정액 샘플을 둡니다.
- 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 5 분 1천그램에 그것을 돌린다.
- 부드럽게 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 제거하고 폐기.
- hypotonic 솔루션을 추가 (KCl, 0.075M) 미리 가열 10 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안, 37 ° C 드롭에 의해 드롭.
- 37 물 목욕에 튜브를 삽입 ° C를 30 분.
- 5 분 1천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고, decantation로 뜨는 폐기하십시오.
- 8 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안 드롭하여 드롭 : 펠렛을 resuspending 후, 갓 Carnoy의 정착액을 (초산 3시 1분 메탄올) 준비 추가할 수 있습니다.
- 흰색 펠렛을 얻기 위해 필요한만큼 여러 번 같은 점 6과 7을 반복합니다.
- 신선한 메탄올 추가 : 초산 (3시 1분) (작은 펠릿 분들의 경우 확산 좋은 세포를 얻는 데 필요한 세포 농도 최종 음량을 조절하기 위해 드롭하여 드롭을 몇 방울이 높은 양의 샘플 반면에 충분합니다 정자가 회복의 최종 볼륨) 1-2 ML에 도달할 수 있습니다. 테스트 슬라이드 ungreased 슬라이드에 resuspended 샘플을 포기하고 위상 콘트라스트 현미경을 조사하여 만들 수 있습니다. 이것은 얻은 세포 분산을 확인하고 필요한 경우 추가로 슬라이드에, 그것을 정정 허용됩니다 드릴 것입니다.
- 확장, 40cm의 최소 높이에서 드롭 unfrosted 슬라이드의 중앙에 세포 현탁액의 두 개 또는 세 방울 (이전에 그들을 degrease -20 ° C에서 메탄올에 저장).하려면 프로토콜을 통해 시료의 위치를 사용하려면, 다이아몬드 연필을 사용하여 슬라이드의 반대편에있는 정자 확장을 포함하고있는 영역을 표시합니다.
- 최소한 24 시간 동안 -20 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
참고 : 메탄올의 추가 : 초산 (3시 1분) 드롭 들러 혼합은 정자 집계의 형성을 피하기 위해 매우 중요한 단계 동안.
II. Decondensation
- 슬라이드는 -20 ° C에 저장된는 (상온에서 그들을두고) 프로토콜과 함께 계속해서 사인을 알아낼 수 없을해야합니다.
- 삼분 각 2X 호수 - 나트륨 구연 산염 솔루션 (2xSSC)로 연속 2 코플린 단지에있는 슬라이드를 놓습니다.
- 각 코플린 병 2 분 에탄올 세척 일련의를 통해 슬라이드를 전송합니다. , 70 % 에탄올로 시작 90%에 의해 따라 100 % 완료. 실온에서 그것을두고 슬라이드를 건조시킵니다.
- 37 dithiothreitol 솔루션 슬라이드 (1,4 - dithiothreitol 5mM, 1 % 트리톤 X - 100, 2 - 아미노 -2 - (히드록시 메틸) -1,3 - propanediol 50mM)을 품어 ° 인큐베이터에서 C는 염색질을 decondense 수 있습니다. 이 제품은 마리의 정자 수야 핵에 protamines의 이황화 다리 해당 코일 DNA를 깨는하여 역할을합니다. 정자의 핵에있는 DNA가 높은 압축되기 때문에 이것은 매우 중요한 단계입니다. dithiothreitol 솔루션 (DTT)의 슬라이드의 배양 시간은이 제품에 대한 샘플의 반응에 따라 조정해야합니다. 그 2로 15 분 거리에 따라 다를 수 있지만 일반적으로,이 시간은 8 분 정도입니다.
- 즉시 각 코플린 3 분 2xSSC 두 개의 연속 코플린의 단지로 슬라이드를 전송합니다.
- 각 코플린 병 (70 %, 90 % 및 100 % 에탄올) 2 분 에탄올 세척 일련의를 통해 슬라이드를 삽입하여 계속합니다. 상온에서 밖으로 건조에 슬라이드를하자.
참고 : 너무 짧은 노출이 어떤 신호의 부족을 초래 하리라는 반면, DTT에 과도한 노출은 프로 시저의 끝에 물고기 신호를 분산 나타날 수 있습니다.
III. 이종 교잡
- 73에서 포름 아미드 용액 (70 % Formamide/2xSSC) · 5 분 C와 코플린 병에 슬라이드를 잠복기하여 정자의 DNA를 변성.
- 코플린 병 당 일분 (70 % 에탄올과 85 %를 시작하고 100 % 완료)에 대한 에탄올의 솔루션을 통해 슬라이드를 전송합니다. 상온에서 밖으로 건조하는 슬라이드를 둡니다.
- 의 직접 5리터 추가 대응 준비 - 사용 15x15 커버 슬립 (AneuVysion 분석 멀티 컬러 프로브 패널 : CEP 18/X/Y 또는 LSI 21분의 13)에 프로브 혼합합니다.
- 그것이 동영상에 나와있는, 대상 지역 및 프로브 혼합물을 함께 넣어 커버 슬립에 슬라이드를 조심스럽게 넣습니다. 고무 시멘트로 밀봉합니다.
- 미리 예열 37에 슬라이드를 삽입 ° C 하이브리드화 챔버 (HYBrite ™) 및 6~24시간에 대한 ° C 37를 품어.
참고 : 정자 샘플의 변성이 필수적인 반면, 프로브를 denaturing의 필요성은 제조 업체에 의해 결정됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 프로브 혼합물은 사용할 수 있으며,이 경우, 프로브 변성이 필요하지 않습니다.
프로브 혼합물의 볼륨 hybridized 영역의 크기에 따라 달라집니다.
IV. 씻는다포스트 하이브 리다이 제이션
- 하이브 리다이 제이션 챔버에서 슬라이드를 꺼내주세요.
- 고무 시멘트를 제거하고 조심스럽게쪽으로 부드럽게 슬라이딩 커버 슬립을 빼낸다.
- unspecific 하이브리드화 신호를 제거하려면 0.4xSSC/0.3 %와 코플린 병 2 분 동안 슬라이드를 장소 NP - 40 미리 예열 73 °에서 물을 욕조에 C.
- 1 분 상온에서 2xSSC/0.1 % NP - 40 세척 솔루션에 슬라이드를 전송합니다. 상온에서 밖으로 건조에 슬라이드를하자.
- 대상 지역 (18x18 커버 슬립 8 L)에 counterstaining 제품을 추가합니다. 사용되는 가장 일반적인 제품 4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI, Vysis 주식 회사)입니다.
- 그것이 동영상에 나와있는, 커버 슬립 (커버 슬립이 손톱 바니와 함께 날인 수있는 하이브 리다이 제이션을 유지하기 위해)와 hybridized 지역을 커버.
- 그들의 전망 분석까지 어둠 속에 -20 ° C에서 hybridized 슬라이드를 저장합니다. 이러한 조건 아래 슬라이드는 형광 신호 강도에 상당한 손실없이 12 개월 동안 저장할 수 있습니다.
참고 : 반대 unspecific 프로브 hybridizations을 씻지 않았 반면, 높은 온도 또는 과도한 세척 시간이 일부 신호의 제거에 발생할 수 있습니다.
추가 counterstaining 제품의 볼륨 충당하기 위해 하이브 리다이 제이션 영역의 크기에 따라 달라집니다.
V. 시각화
준비는 DAPI / 텍사스 레드 / FITC와 단일 밴드 아쿠아, FITC와 텍사스 레드에 대한 필터 트리플 밴드 필터가 장착된 epifluorescence 현미경으로 평가할 수 있습니다. 표준 평가 기준은 정자의 핵 1의 올바른 평가를 따라야합니다.
염색체 X, Y 및 18 탐사선과 hybridized 준비 이러한 세 염색체에 대한 신호를 표시해야합니다. 모든 정상 마리의 정자 수야 한 파란 신호 (염색체 18에 해당), 그리고 녹색 신호 (X 베어링 마리의 정자 수야) 또는 빨간 신호 (Y - 베어링 마리의 정자 수야)를 제시해야합니다.
염색체 13, 21 염색체 13 염색체 21 붉은 신호 녹색 신호 프로브와 함께 hybridized 준비의 모든 정상 마리의 정자 수야에서 구별해야합니다.
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Discussion
이 프로토콜은 정자 물고기 준비를위한 인간의 정액 샘플을 처리하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 남성의 염색체 이상 gametes를 분석하는 것이 가능합니다. 마리의 정자 수야 aneuploidy 심사는 기초 연구의 맥락과 불임 남성에게 주어진 생식 조언에 두 응용 프로그램이 있습니다. 임상 진단에 가장 널리 연구 염색체는 X, Y, 13, 18 및 21 염색체와 loci 광범위한 다른 상용 프로브은 사용할 수 있으며, 이러한 실험에서도 사용할 수 있지만.
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Acknowledgments
이 작품은 Generalitat 드 Catalunya (2005 - SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 그들의 자신의 기술 지원에 대한 감독과 격려, 그리고 J. 루카스에 대한 J. 블랑코와 F. 비달에 감사드립니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
