Summary
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência
Abstract
Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência.
Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo.
Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21.
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.
Protocol
I. O processamento da amostra e fixação de células
- Deixe a amostra de sêmen em recipientes esterilizados em temperatura ambiente por 20 minutos até que a liquefação.
- Transferir a amostra para um tubo de centrífuga e girá-lo em 1000g por 5 minutos.
- Remova cuidadosamente e desprezar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur.
- Adicionar solução hipotônica (KCl, 0.075M) pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 10 ml.
- Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C por 30 minutos.
- Centrifugar a 1000g por 5 minutos. Cuidadosamente desprezar o sobrenadante por decantação, sem perturbar o sedimento.
- Depois de ressuspender o sedimento, adicionar preparados na hora de Carnoy (metanol 03:01: ácido acético) fixador gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 8 ml.
- Repetir os pontos 6 e 7 quantas vezes forem necessárias para obter um pó branco.
- Adicionar metanol preparados na hora: ácido acético (3:1), gota a gota para ajustar o volume final para a concentração celular exigidos para a obtenção de células boa divulgação (nos casos com uma bola pequena, algumas gotas serão suficientes enquanto amostras com uma quantidade elevada de espermatozóides recuperados, o volume final pode chegar a 1-2 ml). A lâmina pode ser feita por deixar cair a amostra ressuspenso em um slide ungreased e examiná-la sob um microscópio de contraste de fase. Isso permitirá verificar a dispersão de celulares obtidos e permitirá corrigi-lo, se for necessário, em slides adicionais.
- Para fazer com que as extensões, queda de uma altura mínima de 40 cm duas ou três gotas de suspensão de células para o centro de slides unfrosted (anteriormente armazenados em metanol a -20 ° C para as desengordurar). Para possibilitar a localização da amostra durante todo o protocolo, marque a área que contém a extensão de esperma no lado oposto da lâmina utilizando um lápis de diamante.
- Armazenar os slides a -20 ° C durante pelo menos 24 horas.
Nota: A adição de metanol: ácido acético (3:1), gota a gota enquanto mistura é um passo muito importante para evitar a formação de agregados de esperma.
II. Descondensação
- As lâminas armazenadas a -20 ° C devem ser descongelados para continuar com o protocolo (deixá-los em temperatura ambiente).
- Coloque o slide em dois frascos coplin consecutivos com solução de citrato de sódio 2x solução salina (2xSSC) por 3 minutos cada.
- Transferir as lâminas através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin. Comece com etanol 70%, seguido de 90% e terminar com 100%. Secar a lâmina, deixando-o em temperatura ambiente.
- Incubar as lâminas em solução ditiotreitol (1,4-ditiotreitol 5mM, Triton 1% X-100, 2-Amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol 50mm) a 37 ° C na incubadora para decondense a cromatina. Este produto age quebrando as pontes de dissulfeto do protaminas que bobina o DNA no núcleo espermatozóides. Este é um passo muito importante porque o DNA no núcleo de esperma é altamente compactado. O tempo de incubação das lâminas em solução ditiotreitol (TDT) devem ser ajustados de acordo com a reatividade da amostra para este produto. Normalmente, este tempo é de cerca de 8 minutos, embora possa variar de 2 a 15 minutos.
- Imediatamente, transferir o slide para dois potes consecutivos coplin com 2xSSC por 3 minutos em cada coplin.
- Continue colocando a lâmina através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin (70%, 90% e 100% de etanol). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
Nota: A exposição excessiva à TDT resultaria em dispersar os sinais de FISH no final do procedimento, enquanto que uma exposição muito curto resultaria em uma falta de alguns sinais.
III. Hibridização
- Desnaturar o DNA do esperma, incubando o slide em um frasco com solução de formamida coplin (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C por 5 minutos.
- Transferir as lâminas através de soluções de etanol para 1 minuto por coplin jar (começar com etanol 70%, 85% e terminar com 100%). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
- Adicionar diretamente l 5 do correspondente ready-to-use a mistura para uma sonda lamínula 15x15 (Painel Probe Assay AneuVysion Multi-color: CEP 18/X/Y ou LSI 13/21).
- Como é mostrado no vídeo, coloque cuidadosamente o slide sobre a lamínula para unir a região-alvo e da mistura da sonda. Selá-lo com cimento de borracha.
- Coloque o slide em uma pré-aquecido 37 ° C câmara de hibridação (HYBrite ™) e incubar-lo a 37 ° C por 24/06 horas.
Nota: Considerando que a desnaturação da amostra de esperma é obrigatória, a necessidade de desnaturação das sondas é determinado pelo fabricante. As misturas sondas utilizadas neste protocolo está pronto para usar e, neste caso, desnaturação da sonda não é necessária.
O volume da mistura sonda irá variar de acordo com o tamanho da área hibridizada.
IV. Lavagenspós-hibridização
- Retire a lâmina da câmara de hibridização.
- Remover o cimento de borracha e com cuidado retire a lamínula de correr suavemente para o lado.
- Para eliminar os sinais de hibridação inespecífica lugar do slide por 2 minutos em uma jarra com coplin 0.4xSSC/0.3% NP-40 pré-aquecido a 73 ° C em banho-maria.
- Transferir as lâminas para uma solução 2xSSC/0.1% NP-40 lavar em temperatura ambiente por 1 minuto. Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
- Adicionar um produto de contraste para a região de destino (8 l para uma lamínula 18x18). O produto mais utilizado é de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
- Como é mostrado no vídeo, cobrir a região hibridizada com uma lamínula (para preservar a hibridização da lamínula pode ser selada com verniz das unhas).
- Loja slides hybridized a -20 ° C no escuro até a sua análise perspectiva. Sob essas condições os slides podem ser armazenadas por até 12 meses sem perda significativa da intensidade do sinal de fluorescência.
Nota: A temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessiva pode resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o oposto não lavar a sonda hibridizações inespecíficas.
O volume do produto adicionado contracoloração irá variar de acordo com o tamanho da área de hibridação para cobrir.
Visualization V.
As preparações podem ser avaliados sob um microscópio de epifluorescência equipado com um filtro de banda tripla para DAPI / Texas Red / FITC e única banda de filtros para Aqua, FITC e Red Texas. Critérios de avaliação padrão devem ser seguidas para a correta avaliação dos núcleos de esperma 1.
A preparação hibridizado com sondas para os cromossomos X, Y e 18 devem mostrar sinais para estes três cromossomos. Todos os espermatozóides normais deve mostrar um sinal azul (correspondente ao cromossomo 18), e um sinal verde (X-rolamento espermatozóides) ou um sinal vermelho (Y-rolamento espermatozóides).
Na preparação hibridizado com sondas para os cromossomos 13 e 21, um sinal verde para o cromossomo 13 e um sinal vermelho para o cromossomo 21 deve ser diferenciado em todos os espermatozóides normais.
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Discussion
Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão disponíveis e também podem ser usados nesses experimentos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Os autores agradecem a J. Blanco e F. Vidal para a sua supervisão e encorajamento, e Lucas J. para a sua assistência técnica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
