Fluorescencia In situ (FISH) Protocolo en el esperma humano

Summary

Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo se procesa una muestra de semen para lograr una buena calidad de fluorescencia

Abstract

Aneuploidías son las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos. La mayoría de estas anomalías el resultado de errores durante el proceso de meiosis gametogénico en los padres. En los machos humanos, estos errores pueden conducir a la producción de espermatozoides con anomalías cromosómicas numéricas que representan un mayor riesgo de transmisión de estas anomalías a la descendencia.

Por esta razón, la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de los espermatozoides se ha convertido en un protocolo ampliamente incorporado en el contexto del diagnóstico clínico. Esta práctica proporciona una estimación de la frecuencia de anomalías cromosómicas numéricas en los gametos de los pacientes que buscan el consejo genético reproductivo.

Hasta la fecha, los cromosomas más frecuentemente incluidos en el análisis de esperma de pescado son los cromosomas X, Y, 13, 18 y 21.

Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo procesar y fijar una muestra de semen humano, cómo decondense y desnaturalizar la cromatina de los espermatozoides, la forma de proceder para obtener preparaciones de esperma de pescado, y la forma de visualizar los resultados en el microscopio. Comentarios especiales de los pasos más relevantes se dan para alcanzar los mejores resultados.

Protocol

I. tratamiento de las muestras y la fijación de células

1. Deja la muestra de semen en recipientes estériles a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta la licuefacción.
2. Transferir la muestra a un tubo de centrífuga y girar a 1000 g durante 5 minutos.
3. Retire con cuidado y descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
4. Añadir una solución hipotónica (KCl, 0.075M) pre-calentado a 37 ° C, gota a gota, mientras se mezcla en un vórtice de obtener un volumen final de 10 ml.
5. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos.
6. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Elimine con cuidado el sobrenadante por decantación, sin perturbar el precipitado.
7. Después de resuspender el pellet, añada recién preparada fijador de Carnoy (3:1 metanol: ácido acético) gota a gota mientras se mezcla en un vórtice de obtener un volumen final de 8 ml.
8. Repetir los puntos 6 y 7 tantas veces como sea necesario para obtener una bolita blanca.
9. Añadir metanol recién preparada: ácido acético (3:1) gota a gota para ajustar el volumen final a la concentración celular requerida para la obtención de células buena difusión (en los casos con una pequeña bolita, unas cuantas gotas será suficiente mientras que las muestras con una gran cantidad de los espermatozoides recuperados, el volumen final puede llegar a 1-2 ml). Una diapositiva de prueba se puede hacer dejando caer la muestra se resuspendió en una diapositiva sin engrasar y examinarla bajo el microscopio de contraste de fase. Esto le permitirá comprobar la dispersión celular obtenido y que permita corregir, si es necesario, en una presentación de más.
10. Para hacer las extensiones, la caída de una altura mínima de 40 cm de dos o tres gotas de la suspensión celular en el centro de las diapositivas no congelado (previamente almacenados en metanol a -20 ° C para desengrasar). Para permitir la ubicación de la muestra durante todo el protocolo, marque el área que contiene la extensión de espermatozoides en el lado opuesto de la diapositiva con un lápiz de diamante.
11. Tienda de las diapositivas a -20 ° C durante al menos 24 horas.
    Nota: La adición de metanol: ácido acético (3:1) gota a gota, mientras que la mezcla es un paso muy importante para evitar la formación de agregados de espermatozoides.

II. Descondensación

1. Las diapositivas almacenadas a -20 ° C debe ser descongelado para continuar con el protocolo (dejarlos a temperatura ambiente).
2. Colocar el portaobjetos en dos frascos de Coplin consecutivos con una solución de 2x citrato salino-sódico (2XSSC) durante 3 minutos cada uno.
3. La transferencia de la diapositiva a través de una serie de lavados de etanol durante 2 minutos en cada frasco de Coplin. Comience con etanol al 70%, sigue en un 90% y terminar con un 100%. Secar el portaobjetos dejando a temperatura ambiente.
4. Incubar el portaobjetos en la solución de ditiotreitol (1,4-ditiotreitol 5 mM, 1% Triton X-100, 2-amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol 50 mm) a 37 ° C en la incubadora para decondense la cromatina. Este producto actúa rompiendo los puentes disulfuro de las protaminas que la bobina del ADN en el núcleo de los espermatozoides. Este es un paso muy importante porque el ADN en el núcleo del espermatozoide está muy compactado. El tiempo de incubación de los portaobjetos en solución de ditiotreitol (DTT) debe ajustarse de acuerdo a la reactividad de la muestra de este producto. Por lo general, esta vez es de alrededor de 8 minutos, aunque puede variar de 2 a 15 minutos.
5. Inmediatamente, la transferencia de la diapositiva a dos jarras Coplin consecutivos con 2XSSC durante 3 minutos en cada uno de Coplin.
6. Continúe colocando la diapositiva a través de una serie de lavados de etanol durante 2 minutos en cada frasco de Coplin (70%, 90% y el 100% de etanol). Dejó caer a secar a temperatura ambiente.
   Nota: La exposición excesiva a la TDT se traduciría en dispersar a las señales de FISH en el final del procedimiento, mientras que una exposición muy corta podría resultar en una falta de algunas señales.

III. Hibridación

1. Desnaturalizar el ADN de los espermatozoides mediante la incubación de la diapositiva en un frasco Coplin con una solución de formamida (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C durante 5 minutos.
2. La transferencia de la diapositiva a través de soluciones de etanol durante 1 minuto por cada frasco de Coplin (empezar con etanol al 70%, 85% y terminar con un 100%). Salga de la diapositiva a secar a temperatura ambiente.
3. Añadir directamente de 5 l de la correspondiente lista para usar mezcla de sondas de una hoja de cubierta de 15x15 (Ensayo AneuVysion Multi-color del panel de la sonda: CEP 18/X/Y o 13/21 LSI).
4. Como se muestra en el video, se coloca cuidadosamente la diapositiva en la hoja de la cubierta de armar la región de destino y la mezcla de la sonda. Sellarlo con cemento de goma.
5. Colocar la placa en un 37 precalentado ° C cámara de hibridación (HYBrite ™) y se incuba a 37 ° C durante 6-24 horas.
   Nota: Considerando que la desnaturalización de la muestra de esperma es obligatorio, la necesidad de la desnaturalización de las sondas está determinado por el fabricante. Las mezclas de sonda utilizada en este protocolo están listos para usar y, en este caso, la desnaturalización de la sonda no es necesario.
   El volumen de la mezcla de la sonda varía según el tamaño de la zona de hibridación.

IV. Lavapost-hibridación

1. Sacar el portaobjetos de la cámara de hibridación.
2. Quitar el cemento de caucho y tire con cuidado la hoja de cubierta deslizante suavemente a un lado.
3. Para eliminar las señales de hibridación no específica el lugar de la diapositiva durante 2 minutos en un frasco Coplin con 0.4xSSC/0.3% NP-40 pre-calentado a 73 ° C en un baño de agua.
4. Transferir el portaobjetos a una solución 2xSSC/0.1% NP-40 de lavado a temperatura ambiente durante 1 minuto. Dejó caer a secar a temperatura ambiente.
5. Añadir un producto contratinción de la región de destino (8 l de una hoja de cubierta 18x18). El producto más utilizado es de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
6. Como se muestra en el vídeo, la cobertura de la región hibridada con una hoja de cubierta (para preservar la hibridación puede ser la hoja de la cubierta sellada con esmalte de uñas).
7. Almacenar los portaobjetos hibridados a -20 ° C en la oscuridad hasta su análisis la perspectiva. En estas condiciones, las diapositivas se pueden almacenar hasta 12 meses sin pérdida significativa en la intensidad de la señal de fluorescencia.
   Nota: Una temperatura más alta o un tiempo de lavado excesivo puede resultar en la eliminación de algunas señales, mientras que lo contrario no se lave las hibridaciones inespecíficas de la sonda.
   El volumen del producto contratinción añadido variará según el tamaño de la zona de hibridación de principio a fin.

V. Visualización

Las preparaciones pueden ser evaluadas bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con un filtro de triple banda de DAPI / Texas Red / FITC y la banda de un solo filtro de Aqua, FITC y Red Texas. Los criterios estándar de evaluación se deben seguir para la correcta evaluación de los núcleos de espermatozoides ^1.

La preparación de hibridación con sondas para los cromosomas X, Y y 18 debe mostrar señales de estos tres cromosomas. Todos los espermatozoides normales debe mostrar una señal de color azul (que corresponde al cromosoma 18), y una luz verde (X portador de espermatozoides) o una señal en rojo (de rodamientos espermatozoides).

En la preparación de hibridación con sondas para los cromosomas 13 y 21, una señal verde para el cromosoma 13 y una señal en rojo para el cromosoma 21, ha de distinguirse en todos los espermatozoides normales.

Discussion

Este protocolo describe la forma de procesar las muestras de semen humano para la obtención de preparaciones de esperma de pescado. El uso de este protocolo es posible analizar las anomalías cromosómicas en los gametos masculinos. Los espermatozoides de detección de aneuploidía tiene aplicaciones tanto en el contexto de la investigación básica y en el consejo reproductivo dado a los hombres infértiles. Aunque en el diagnóstico clínico de los cromosomas más estudiados son X, Y, 13, 18 y 21 de otras sondas comerciales para una amplia gama de los cromosomas y lugares están disponibles y también puede ser utilizado en estos experimentos.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche Group	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche Group	10708976001
Acetic acid	Material	Merck & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nalge Nunc international	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15x15)	Material	Knittel Glaser	4600115
Cover slips (18x18)	Material	Knittel Glaser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck & Co., Inc.	100.983
Formamide	Material	Roche Group	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus Corporation	35505
Incubator	Tool	Heraeus Instruments
Methanol	Material	Merck & Co., Inc.	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus Corporation		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Instruments
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel Glaser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tweezers	Material	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®