Summary
Denna video-artikeln beskrivs steg för steg, hur du bearbetar ett spermaprov för att uppnå god kvalitet fluorescens
Abstract
Aneuploidies är de mest frekventa kromosomavvikelser hos människor. De flesta av dessa avvikelser beror på meiotiska fel under gametogenic processen i föräldrarna. Hos män, kan dessa fel leda till att produktionen av spermier med numeriska kromosomavvikelser som innebär en ökad risk för överföring av dessa anomalier till avkomman.
Av denna anledning har tekniken av fluorescens in situ hybridisering (FISH) på spermier kärnor bli ett protokoll som ofta ingår i samband med klinisk diagnos. Denna praxis ger en uppskattning av frekvenserna av numeriska kromosomavvikelser i könscellerna av de patienter som söker för genetiska reproduktiv råd.
Hittills kromosomerna oftast ingår i spermier FISH analys är kromosomerna X, Y, 13, 18 och 21.
Denna video-artikeln beskrivs steg för steg, hur man bearbeta och fastställa en mänsklig spermaprov, hur man decondense och förstörs sperman kromatin, hur man ska gå för att få spermier fiskprodukter, och hur man visualisera resultaten i mikroskopet. Särskilda anmärkningar av de mest relevanta steg ges för att uppnå bästa resultat.
Protocol
I. Exempel på bearbetning och cell-fixering
- Lämna spermaprov i sterila behållare i rumstemperatur i 20 minuter tills kondensering.
- Överför provet till ett centrifugrör och centrifugera det på 1000g i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med hjälp av en pasteurpipett.
- Lägg hypoton lösning (KCl, 0.075M) förvärmd vid 37 ° C, droppe för droppe, medan blandning på en virvel för att få en slutlig volym på 10 ml.
- Placera röret i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 minuter.
- Centrifugera vid 1000g i 5 minuter. Försiktigt kassera supernatanten genom dekantering, utan att störa pelleten.
- Efter resuspending pelleten, lägga nylagade Carnoy är fixativ (3:1 metanol: ättiksyra) droppvis under omrörning i en virvel för att få en slutlig volym på 8 ml.
- Upprepa punkt 6 och 7 så många gånger som krävs för att få en vit pellet.
- Lägg nyberedd metanol: ättiksyra (3:1) droppvis för att justera den slutliga volymen till den cellulära koncentrationen krävs för att få bra cell spridning (i de fall med en liten pellets kommer några droppar räcker medan prover med en stor mängd av spermier återvinns kan den slutliga volymen når 1-2 ml). Ett test bild kan göras genom att släppa den återsuspenderade provet på en osmord bild och undersöka den under ett faskontrastmikroskop. Detta kommer att låta kontrollera cellulära spridning uppnås och skulle ge korrigera det, om det är nödvändigt, ytterligare bilder.
- För att göra förlängningar, nedgång från en höjd på minst 40 cm två eller tre droppar cellsuspension i mitten av unfrosted diabilder (tidigare lagrats i metanol vid -20 ° C till avfettats). För att möjliggöra placering av provet hela protokollet, markera det område som innehåller spermier förlängningen på motsatt sida av bilden med hjälp av en diamant penna.
- Förvara bilderna vid -20 ° C i minst 24 timmar.
Anmärkning: Tillägg av metanol: ättiksyra (3:1) droppvis under omrörning är ett mycket viktigt steg för att undvika bildandet av spermier aggregat.
II. Decondensation
- Bilderna lagras vid -20 ° C måste tinas för att fortsätta med protokollet (lämna dem i rumstemperatur).
- Placera bilden i två på varandra följande Coplin burkar med 2x koksaltlösning-natriumcitratlösning (2xSSC) i 3 minuter vardera.
- Överför bilden genom en serie av etanol tvättar i 2 minuter i varje Coplin burk. Börja med 70% etanol, följ med 90% och avsluta med 100%. Torka ut bilden lämnar den i rumstemperatur.
- Inkubera bilden i ditiotreitol lösning (1,4-ditiotreitol 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroximetyl) -1,3-propandiol 50mm) vid 37 ° C i inkubatorn att decondense kromatinet. Denna produkt fungerar genom att bryta disulfidbryggor av protamines att spolen DNA i spermier kärnan. Detta är ett mycket viktigt steg eftersom DNA i sperma kärnan är mycket kompakt. Inkubationstiden för diabilder i ditiotreitol lösning (DTT) måste anpassas efter provets reaktivitet för denna produkt. Vanligtvis är denna gång 8 minuter, men det kan variera från 2 till 15 minuter.
- Omedelbart överföra bilden till två på varandra följande Coplin burkar med 2xSSC i 3 minuter i varje Coplin.
- Fortsätt genom att placera bilden genom en serie av etanol tvättar i 2 minuter i varje Coplin burk (70%, 90% och 100% etanol). Låt bilden för att torka ut i rumstemperatur.
Obs: Överdriven exponering för DTT skulle resultera i skingra FISH signaler i slutet av förfarandet, medan en för kort exponering skulle resultera i en brist på vissa signaler.
III. Hybridisering
- Denaturera spermiens DNA genom inkubation bilden i ett Coplin burk med formamid-lösning (70% Formamide/2xSSC) vid 73 ° C i 5 minuter.
- Överför glida igenom etanolen lösningar för 1 minut per Coplin burk (börja med 70% etanol, 85% och avsluta med 100%). Låt bilden för att torka ut i rumstemperatur.
- Lägg direkt 5 l för motsvarande färdiga att använda probe blandningen till en 15x15 täckglas (AneuVysion analys flerfärgade Probe Panel: CEP 18/X/Y eller LSI 13/21).
- Som framgår i videon, försiktigt placera bilden på locket glida att sätta ihop målet regionen och sonden blandningen. Försegla den med gummi cement.
- Placera glida in en förvärmda 37 ° C hybridisering kammaren (HYBrite ™) och inkubera det vid 37 ° C i 6-24 timmar.
Anm: De denaturering av spermier provet är obligatoriskt, är nödvändigheten av denaturering sonderna bestäms av tillverkaren. Sonden blandningar som används i detta protokoll är redo att använda och, i detta fall är prob denaturering inte.
Volymen av sonden blandning kommer att variera beroende på storleken på hybridiserade området.
IV. Tvättarpost-hybridisering
- Ta ut bild i hybridisering kammaren.
- Ta bort klister och försiktigt dra ut locket glida glider försiktigt åt sidan.
- För att eliminera ospecifika hybridisering signalerna plats i bilden i 2 minuter i en Coplin burk med 0.4xSSC/0.3% NP-40 förvärmas vid 73 ° C i ett vattenbad.
- Överför bilden till en 2xSSC/0.1% NP-40 tvättlösning i rumstemperatur i 1 minut. Låt bilden för att torka ut i rumstemperatur.
- Lägg till en motfärgning produkt till målet regionen (8 l för en 18x18 täckglas). Den vanligaste produkt som används är 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
- Som framgår i videon, täcka hybridiseras regionen med ett täckglas (för att bevara hybridisering locket glida kan tätas med nagellack).
- Förvara hybridiseras diabilder vid -20 ° C i mörker tills deras utsikter analys. Under dessa förhållanden bilderna kan lagras i upp till 12 månader utan betydande vilse i fluorescens signalstyrka.
Anm: En högre temperatur eller en överdriven tvätt tid kan resultera i avskaffandet av vissa signaler, medan det motsatta inte skulle tvätta ur ospecifika sond hybridizations.
Volymen av det tillsatta motfärgning produkten kommer att variera beroende på storleken på hybridisering område att täcka.
V. Visualisering
Förberedelserna kan utvärderas under en epifluorescensmikroskop försedd med en tredubbel-band filter för DAPI / Texas Red / FITC och ett band filter för Aqua, FITC och Texas Red. Standard bedömningskriterier måste följas för en korrekt utvärdering av spermier kärnor 1.
Beredningen hybridiseras med givare för kromosomerna X, Y och 18 bör visa signaler för dessa tre kromosomer. Alla normala spermier ska visa en blå signal (motsvarande kromosom 18), och en grön signal (X-bärande spermier) eller en röd signal (Y-bärande spermier).
I beredningen hybridiseras med givare för kromosomerna 13 och 21, en grön signal för kromosom 13 och en röd signal för kromosom 21 bör särskiljas i alla normala spermier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur att behandla människor sperma prover för att få förberedelser spermier FISK. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att analysera kromosomavvikelser hos manliga könsceller. Spermier aneuploidi screening har tillämpningar antingen i samband med grundforskning och i det reproduktiva råd som ges till infertila män. Även i klinisk diagnos det mest studerade kromosomer är X, Y, 13, 18 och 21, andra kommersiella sonder för ett stort antal kromosomer och loci är tillgängliga och kan även användas i dessa experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Författarna tackar till J. Blanco och F. Vidal för deras tillsyn och uppmuntran, och J. Lucas för hans tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
