Summary
זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה פלואורסצנטי
Abstract
Aneuploidies הם פגמים בכרומוזומים השכיח ביותר בבני אדם. רוב הפרעות אלו נובעות שגיאות meiotic בתהליך gametogenic אצל ההורים. אצל גברים אנושיים, שגיאות אלה יכולים להוביל לייצור של זרע עם הפרעות כרומוזום מספריים המייצגים סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלה לצאצאים.
מסיבה זו, את הטכניקה של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על גרעין הזרע הפך פרוטוקול שולבו נרחב בהקשר של אבחנה קלינית. בפועל זה מספק אומדן של תדרים של הפרעות כרומוזום מספריים הגמטות של המטופלים המבקשים ייעוץ גנטי הרבייה.
עד כה, את הכרומוזומים כללו לרוב בניתוח FISH הזרע הם כרומוזומי X, Y, 13, 18 ו - 21.
זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, איך לעבד ולתקן דגימת זרע אנושי, איך decondense ו לפגל הכרומטין זרע, כיצד להמשיך לקבל ההכנות FISH הזרע, וכיצד לחזות את התוצאות במיקרוסקופ. הערות מיוחדות הצעדים המשמעותיים ביותר ניתנים על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
Protocol
I. עיבוד המדגם קיבוע התא
- השאירו את מדגם הזרע במכלים סטריליים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד עיבוי.
- מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות ספין אותו 1000g במשך 5 דקות.
- הוצא בעדינות וזורקים supernatant באמצעות פיפטה פסטר.
- הוסף פתרון hypotonic (KCl, 0.075M) מחומם מראש על 37 ° C, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח סופי של 10 מ"ל.
- מניחים את הצינור באמבטיה המים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 1000g במשך 5 דקות. בזהירות להתעלמות supernatant ידי יציקה, מבלי להפריע גלולה.
- לאחר resuspending גלולה, להוסיף המוכן טרי (מתנול 03:01: חומצה אצטית) מקבע של Carnoy טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח הסופי של 8 מ"ל.
- חזור נקודות 6 ו -7 פעמים רבות ככל הדרוש כדי להשיג גלולה לבנה.
- הוסף מתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה כדי לכוונן את עוצמת הריכוז הסופי הסלולר הנדרש לקבלת תא טובה מתפשטת (באותם מקרים עם כדורית קטנה, כמה טיפות יספיקו ואילו דגימות עם כמות גבוהה הזרע התאוששה, הנפח הסופי יכול להגיע 1-2 מ"ל). שקופית הבדיקה יכולה להתבצע על ידי הטלת המדגם resuspended לשקופית משומנת ובוחן אותו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. זה יאפשר לבדוק את פיזור הסלולר שהושג יאפשר תיקון זה, אם יש צורך, על שקופיות נוספות.
- כדי להפוך את הרחבות, ירידה מגובה מינימלי של 40 ס"מ שתיים או שלוש טיפות של השעיה תא למרכז שקופיות unfrosted (מאוחסן בעבר ב -20 מעלות צלזיוס מתנול כדי degrease אותם). כדי לאפשר את מיקומו של המדגם לאורך הפרוטוקול, לסמן את האזור המכיל את הזרע הרחבה בצד השני של השקופית באמצעות עיפרון היהלומים.
- אחסן את השקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
הערה: תוספת של מתנול: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב היא צעד חשוב מאוד כדי למנוע היווצרות של אגרגטים הזרע.
השנייה. Decondensation
- השקופיות המאוחסן -20 ° C חייב להיות מופשר להמשיך עם פרוטוקול (להשאיר אותם בטמפרטורת החדר).
- מניחים את השקופית בשתי צנצנות coplin רצופים עם תמיסת מלח נתרן 2x ציטרט (2xSSC) למשך 3 דקות כל אחד.
- העברת השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin. התחל עם 70% אתנול, פעל על ידי 90% ולסיים עם 100%. לייבש את השקופית להשאיר אותו בטמפרטורת החדר.
- דגירה השקופית בתמיסה dithiothreitol (1,4-dithiothreitol 5mm, טריטון 1% X-100, 2-אמינו-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol 50mm) בשעה 37 ° C בחממה כדי decondense הכרומטין. מוצר זה פועל על ידי שבירת גשרים דיסולפיד של protamines כי סליל ה-DNA בגרעין תא הזרע. זהו צעד חשוב מאוד כי ה-DNA בגרעין הזרע נדחס מאוד. זמן הדגירה של שקופיות פתרון dithiothreitol (DTT) חייב להיות מותאם על פי התגובה של מדגם למוצר זה. בדרך כלל, הפעם הוא סביב 8 דקות, למרות שזה יכול להשתנות 2-15 דקות.
- מיד להעביר את השקופית שתי צנצנות ברציפות coplin עם 2xSSC במשך 3 דקות coplin כל אחד.
- המשך על ידי הצבת את השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin (70%, 90% ו 100% אתנול). תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
הערה: חשיפת יתר DTT תביא לפיזור אותות FISH בסוף ההליך, ואילו חשיפה קצר מדי יגרום לחוסר אותות מסוימים.
ג. הכלאה
- לפגל את ה-DNA של הזרע דוגרים השקופית בצנצנת coplin עם פתרון לפוראמיד (70% Formamide/2xSSC) בשעה 73 ° C במשך 5 דקות.
- העברת השקופית באמצעות פתרונות אתנול דקה 1 לכל coplin קנקן (להתחיל עם אתנול 70%, 85% ולסיים עם 100%). השאירו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
- הוסף ישיר l של 5 המקביל מוכן לשימוש תערובת בדיקה לחמוק כיסוי 15x15 (Assay AneuVysion Multi-Probe צבע פאנל: CEP 18/X/Y או LSI 13/21).
- כפי שזה מוצג הוידאו, בזהירות במקום להחליק על פתק את המכסה כדי להרכיב את אזור היעד את התערובת בדיקה. חותם זה במלט גומי.
- מניחים את השקופית לתוך טרום חימם 37 ° C קאמרית הכלאה (HYBrite ™) ו דגירה אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות.
הערה: בעוד denaturation המדגם הזרע היא חובה, את הצורך denaturing בדיקות נקבע על ידי היצרן. תערובות בדיקה השתמשו בפרוטוקול הזה מוכנים לשימוש, במקרה זה, denaturation בדיקה אינה נדרשת.
נפח התערובת בדיקה ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה.
IV. רוחצתלאחר הכלאה
- קח את השקופית מהאולם הכלאה.
- הסר את המלט גומי בזהירות לשלוף את הפתק מכסה מחליק בעדינות הצידה.
- כדי למנוע את האותות הכלאה נוקבים במקום להחליק במשך 2 דקות בתוך צנצנת עם coplin% 0.4xSSC/0.3 NP-40 מראש התחמם ב 73 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- העברת שקופיות פתרון NP-40 לשטוף 2xSSC/0.1% בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
- הוסף מוצר counterstaining לאזור היעד (8 l עבור להחליק לכסות 18x18). המוצר הנפוץ ביותר הוא 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc).
- כפי שזה מוצג הוידאו, לכסות את אזור הכלאה עם תלוש כיסוי (כדי לשמר את ההכלאה להחליק לכסות יכול להיות חתום עם לכה מסמר).
- חנות שקופיות הכלאה ב -20 ° C בחושך עד ניתוח הסיכוי שלהם. בתנאים אלה השקופיות ניתן לאחסן עד 12 חודשים ללא משמעותי לאיבוד עוצמת האות פלואורסצנטי.
הערה: הטמפרטורה גבוהה או זמן לשטוף מופרז עלול לגרום לחיסול של אותות מסוימים, ואילו השני לא היה לשטוף את הכלאות בדיקה נוקבים.
היקף המוצר counterstaining הוסיף ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה לכסות.
V. ויזואליזציה
ההכנות ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במסנן הלהקה משולשת עבור DAPI / טקסס אדום / FITC ו יחיד הלהקה מסננים עבור אקווה, FITC וטקסס האדום. קריטריונים להערכה סטנדרטית חייב להיות במעקב במשך הערכה נכונה של גרעיני זרע 1.
הכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומי X, Y ו 18 צריכים להציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים. כל זרע נורמלית חייב להראות איתות כחול (המקביל ל כרומוזום 18), ואת אות ירוק (X נושאות זרע) או איתות אדום (Y נושאות זרע).
בהכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומים 13 ו - 21, אות ירוק כרומוזום 13 ו סימן אדום על כרומוזום 21 יש להבחין בכל זרע נורמלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך דגימות זרע אנושי להשגת FISH ההכנות הזרע. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח פגמים בכרומוזומים של גמטות זכריות. ההקרנה זרע aneuploidy יש יישומים גם בהקשר של מחקר בסיסי בייעוץ הרבייה שניתנה זכרים עקרים. למרות האבחנה הקלינית הכרומוזומים ביותר למד נרחב הן X, Y, 13, 18 ו 21, בדיקות מסחריים אחרים עבור מגוון רחב של הכרומוזומים לוקוסים זמינים יכול לשמש גם בניסויים אלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מודים ל י פ ו בלאנקו וידאל לפיקוח שלהם עידוד, ג'לוקאס לקבלת סיוע טכני שלו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
