Summary
Bu video-makale, semen örneği nasıl işleneceğini, iyi kalite floresan elde etmek için adım adım açıklanmaktadır
Abstract
Anöploidiler insanlarda en sık görülen kromozom anomalileri. Bu anormalliklerin çoğu anne gametogenic işlemi sırasında mayotik hataları sonucu. Insan erkek, bu hataları yavrular bu anomaliler bulaştırma riski temsil eden sayısal kromozom anomalileri ile sperm üretimine yol açabilir.
Bu nedenle, floresan in situ hibridizasyon (FISH) sperm çekirdekleri tekniği yaygın klinik tanı çerçevesinde kurulmuş bir protokol haline gelmiştir. Bu uygulama, frekansların sayısal kromozom anomalileri, genetik üreme tavsiye için arayan hastaların gamet bir tahmin sağlar.
Bugüne kadar, en sık sperm FISH analizi dahil kromozom kromozomlar X, Y, 13, 18 ve 21.
Bu video-makale, mikroskop sonuçları nasıl görselleştirmek için decondense ve nasıl elde etmek için sperm FISH preparatları devam etmek sperm kromatin, doğasını, nasıl bir insan semen örneği süreci ve düzeltmek için nasıl adım adım ve açıklar. En iyi sonuçları elde etmek için en uygun adımları özel açıklamalar verilmiştir.
Protocol
I. Örnek işleme ve hücre sabitleme
- Semen örneği oda sıcaklığında steril kaplarda sıvılaşma kadar 20 dakika bekletin.
- Örnek bir santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika 1000g çok spin.
- Pasteur pipeti kullanarak süpernatant yavaşça çıkarın ve atın.
- Hipotonik çözüm (KCl, 0.075M) önceden ısıtılmış 10 ml nihai hacmi elde etmek için bir girdap karıştırma, 37 ° C, damla damla.
- 37 bir su banyosunda tüp Yeri ° C 30 dakika.
- 5 dakika 1000g santrifüjleyin. Dikkatle pelet rahatsız olmadan, decantation süpernatantı atın.
- 8 ml nihai hacmi elde etmek için bir girdap karıştırma sırasında damla damla: pelet resuspending sonra, taze Carnoy sabitleştirici (asetik asit 03:01 metanol) hazırlanan ekleyin.
- Beyaz bir pelet elde etmek için gerekli olduğu birçok kez olarak 6 ve 7 noktaları tekrarlayın.
- Birkaç damla taze hazırlanmış metanol ekle: asetik asit (3:1) (Bu gibi durumlarda küçük bir pelet ile yayılıyor iyi hücre elde etmek için gerekli olan hücresel konsantrasyonu son ses seviyesini ayarlamak için damla damla, yüksek miktarda örnekleri ise yeterli olacak sperm, son hacim) 1-2 ml ulaşabilirsiniz. Bir test slayt ungreased bir slayt üzerine yeniden süspanse örnek bırakarak ve bir faz kontrast mikroskop altında inceleyerek yapılabilir. Bu elde edilen hücresel dağılımı kontrol etmek ve gerekirse daha fazla slaytlar, bunu düzeltmek izin verecek.
- Uzantıları, en az 40 cm yükseklikten düşüş unfrosted slaytlar merkezi haline hücre süspansiyonu iki veya üç damla (daha önce onları yağlanmalıdır, -20 ° C'de metanol saklanır). Protokol boyunca örnek yerini etkinleştirmek için, karşı tarafta bir elmas kalem kullanarak slayt sperm uzantısı içeren alan işaretleyin.
- Slaytlar, en az 24 saat süreyle -20 ° C'de saklayın.
Not: metanol ek: asetik asit (3:1) karıştırma, sperm agregaların oluşumunu önlemek için çok önemli bir adım ise damla damla .
II. Decondensation
- Slaytlar -20 saklanan ° C (oda sıcaklığında bekletin) protokol ile devam etmek için çözülmüş olmalıdır.
- Her biri için 3 dakika 2x tuzlu su, sodyum sitrat solüsyonu (2xSSC) ile iki yıl üst üste coplin kavanoz slayt yerleştirin.
- 2 dakika boyunca her coplin kavanoza etanol yıkar bir dizi slayt aktarın. % 70 etanol ile başlayın,% 90 ile takip ve% 100 ile bitiriyoruz. Oda sıcaklığında bırakarak slayt kurulayın.
- Dithiothreitol çözüm slayt (1,4-dithiothreitol 5mM,% 1 Triton X-100, 2-Amino-2-(hidroksimetil) -1,3-propanediol 50mm) inkübe 37 ° C inkübatör kromatin decondense. Bu ürün, spermatozoa çekirdeğinde protamines disülfit köprüleri o bobin DNA kırarak davranır. Sperm çekirdeğinde bulunan DNA yüksek oranda sıkıştırılmış, çünkü bu çok önemli bir adım. Dithiothreitol çözüm slaytları (DTT) inkübasyon süresi, bu ürün için örnek reaktivite göre ayarlanması gerekir. Genellikle 2 ila 15 dakika arasında değişir, ancak bu kez, yaklaşık 8 dakika.
- Hemen her coplin 3 dakika 2xSSC iki ardışık coplin kavanoz slayt aktarın.
- 2 dakika boyunca her coplin kavanoz (% 70,% 90 ve% 100 etanol) etanol yıkar bir dizi slayt koyarak devam edin. Oda sıcaklığında kurumaya slayt olsun.
Not: çok kısa maruz kalma, bazı sinyallerin eksikliği neden olur ise DTT aşırı maruz kalma, prosedürün sonunda BALIK sinyalleri dağıtmak neden olacaktır.
III. Melezleme
- 73 formamid çözüm (70% Formamide/2xSSC) ° C de 5 dakika ile bir coplin kavanoza slayt kuluçka sperm DNA denatüre.
- Coplin kavanoz başına 1 dakika (% 85,% 70 etanol ile başlar ve% 100 ile bitirmek) için etanol çözümleri üzerinden slayt aktarın. Slayt, oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- 5 l doğrudan ilgili hazır kullanımı prob karışımı bir 15x15 kapağı kayma (AneuVysion Testi Çok renkli Probe Panel: CEP 18/X/Y veya LSI 13/21).
- Bu videoda gösterildiği gibi, hedef bölge ve prob karışımı bir araya getirmek için kapak kayma üzerine slayt dikkatlice yerleştirin. Kauçuk çimento ile Seal.
- Slayt koyun önceden ısıtılmış 37 ° C hibridizasyon odası (HYBrite ™) ve 6-24 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
Not: sperm örneği denatürasyon zorunlu olduğunu dikkate alarak, problar denatüre gereği üretici firma tarafından belirlenir. Bu protokolde kullanılan prob karışımları kullanıma hazır olup, bu durumda, prob denatürasyon gerekli değildir.
Sondası karışımın hacmi melezleşmiş alanın büyüklüğüne göre değişecektir.
IV. Yıkarpost-hibridizasyon
- Slayt hibridizasyon odasından çıkarın.
- Kauçuk çimento kaldırın ve yavaşça yan sürgülü kapak kayma dikkatlice dışarı çekin.
- NP-40 0.4xSSC/0.3% belirsiz hibridizasyon sinyalleri ortadan kaldırmak için bir coplin kavanoza 2 dakika boyunca slayt önceden ısınmış 73 az ° C su banyosu.
- 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bir 2xSSC/0.1% NP-40 yıkama solüsyonu slayt aktarın. Oda sıcaklığında kurumaya slayt olsun.
- Counterstaining ürün, hedef bölge (18x18 kapak kaymayı 8 l) ekleyin. Kullanılan en yaygın ürün 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
- Bu videoda gösterildiği gibi, bir kapak kayma (tırnak cilası ile mühürlü kapak kayma olabilir hibridizasyon korumak için) melezleşmiş bölgeyi kapsar.
- Melezleşmiş slaytlar onların umudu analizi kadar -20 ° C'de karanlıkta saklayın. Bu koşullar altında, slaytlar floresan sinyal yoğunluğunda önemli bir kayıp olmadan 12 aya kadar saklanabilir.
Not: tersi belirsiz prob döllemeler yıkayın olmaz ise, yüksek sıcaklık veya aşırı yıkama süresi, bazı sinyalleri ortadan kaldırılmasına neden olabilir .
Eklenen counterstaining ürünün hacmi kapsayacak şekilde hibridizasyon alanının büyüklüğüne göre değişecektir.
V. Görselleştirme
Hazırlıkları DAPI / Texas Red / FITC ve tek bant Aqua, FITC ve Texas Red için filtreler için tri-band filtresi ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop altında değerlendirilebilir. Standart değerlendirme kriterleri sperm çekirdekleri 1 doğru değerlendirilmesi için takip edilmelidir.
Bu üç kromozom kromozomlar X, Y ve 18 probları melezleşmiştir hazırlık sinyalleri görüntüleyebilir. Her normal sperm bir mavi sinyal (18 kromozom karşılık), ve yeşil bir sinyal (X taşıyan sperm) veya kırmızı sinyali (Y taşıyan spermatozoa) göstermek gerekir.
13 ve 21, kromozom, kromozom 13 ve 21 kromozom için kırmızı sinyal yeşil bir sinyal sondaları ile melezleşmiştir hazırlanmasında her normal sperm ayırt edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, sperm FISH preparatları elde etmek için insan semen süreci anlatılmaktadır. Bu protokolü kullanmak, erkek gamet kromozom anormallikleri analiz etmek mümkündür. Spermatozoa anöploidi taraması kapsamında temel araştırma ve infertil erkeklere verilen üreme tavsiye veya uygulamalar vardır. Klinik tanısında en yaygın çalışılan kromozomları X, Y, 13, 18 ve 21, kromozomlar ve lokusların geniş bir yelpazede diğer ticari problar mevcuttur ve bu deneylerde de kullanılabilir olmasına rağmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, onun teknik yardım için denetlemek ve teşvik edilmesi, ve J. Lucas J. Blanco ve F. Vidal için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
