Summary
نحن تقديم
Abstract
الانصهار الغشاء هو خطوة أساسية أثناء دخول الفيروسات يلفها في الخلايا. المقايسات التقليدية الانصهار التقرير عادة على عدد كبير من الأحداث الانصهار ، مما يجعل من الصعب تحليلها كميا تسلسل الخطوات الجزيئية المعنية. طورنا في المختبر ، وهما لونا مقايسة مضان لرصد حركية من جسيمات فيروس واحد الصمامات مع طبقة ثنائية الهدف على دعم السوائل أساسا.
يتم تحضين جزيئات الأنفلونزا الفيروسية مع fluorophore a الأخضر لمحبة للدهون وصمة عار في الغشاء وfluorophore ماء حمراء لصبغ الداخلية الفيروسية. نحن إيداع طبقة ثنائية الدهن غانغليوزيد المحتوية على سطح الزجاج ديكستران - functionilized خلية تدفق الجزيئات الفيروسية احتضان على طبقة ثنائية مستو وصورة مضان من 100 × 100 مساحتها 2 ميكرون ، تحتوي على عدة مئات من الجزيئات ، على اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. بواسطة التصوير كلا من مضان أحمر وأخضر ، ويمكننا رصد سلوك واحد للصباغة غشاء (الخضراء) والمحتوى المائي (أحمر) من الجسيمات.
على خفض درجة الحموضة إلى قيمة أقل من الرقم الهيدروجيني الانصهار ، سوف تندمج مع جزيئات الغشاء. Hemifusion ، ودمج المنشور في الغشاء الخارجي الفيروسية مع النشرة الخارجي للغشاء الهدف ، وسوف تكون واضحة على أنه تغيير مفاجئ في مضان أخضر من الجسيمات. وبناء على الاندماج اللاحقة للمنشورات two القاصي المتبقية يتم تشكيل المسام ، وسوف يتم الافراج عن fluorophore الحمراء التي تنبعث منها في الجسيمات الفيروسية تحت غشاء الهدف. هذا الحدث سوف تؤدي إلى انخفاض في مضان أحمر من الجزيئات الفردية. أخيرا ، ومضان متكاملة من fluorophore الحموضة حساسة مضمن في غشاء الهدف تقارير عن الوقت المحدد لانخفاض الرقم الهيدروجيني.
من آثار مضان وقت الثلاث يمكن ، الآن كل الأحداث الهامة (انخفاض درجة الحموضة ، واختلاط الدهون على المحتوى ، وعند خلط hemifusion تشكيل مسام) يمكن استخراجها بطريقة مباشرة ومنفردة لكل جسيم. من خلال جمع العصر المنقضي لالتحولات المختلفة للكثير من الجزيئات الفردية في رسوم بيانية ، يمكننا تحديد أعمار وسيطة من المقابلة. يمكن أن تكون وسيطة حتى الخفية التي لم يكن لديك تصور يمكن ملاحظتها مباشرة الفلورسنت مباشرة من هذه المدرج الاحصائي.
Protocol
الزجاج functionalization تغطية زلة
يتم اعتماد طبقة ثنائية مستو المستخدمة في فحص الانصهار على فيلم رطب من ديكستران. ديكستران الأفعال كفاصل بين طبقة ثنائية ومستو سطح الزجاج. هذا يمنع من أن تصبح مكونات غشاء عالقة على سطح الزجاج ، ويوفر أيضا في الفضاء الذي محتويات جسيمات الفيروس يمكن الخروج عليها الانصهار. وfunctionalized coverslips الزجاج من خلال المعاملة مع الايبوكسي سيلاني ، والذي يسمح لنا ديكستران السندات كيميائيا على الزجاج (Elender ، وآخرون 1996).
- ترتيب coverslips 25 ملم في رفوف تلوين السيراميك ، ووضع رف في وعاء أو كوب.
- تعبئة الحاوية بمحلول 10 ٪ من المنظفات مختبر الأواني الزجاجية الصف. وضع الحاوية في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
- شطف الحاويات ورفوف ساترة مع الماء منزوع الأيونات ، وإعادة ملء مع هيدروكسيد postassium 1M. عودة الحاوية إلى sonicator الحمام لمدة 30 دقيقة.
- كرر هذا الإجراء التنظيف باستخدام الأسيتون والإيثانول.
- شطف coverlips في مجال المياه والجفاف.
- أخيرا ، وتنظيف coverslips مع الأكسجين متجرد البلازما لمدة ثلاث دقائق.
- الخطوة تنظيف مشاركة يتأكسد السطح ، مما يجعل من الزجاج ماء موحد والتفاعل في الخطوات التالية silanization.
- يعد حل 0.2 ٪ من 3 glycidoxypropyltrimethoxy - سيلاني في الأيزوبروبانول. غمر coverslips في هذا الحل لمدة خمس دقائق.
- تجاهل حل سيلاني وشطف مرات عدة في coverslips الأيزوبروبانول.
- والمغلفة الآن coverslips بطبقة من سيلاني ، ولكن يجب أن يشفى للسماح لسيلاني السندات تساهميا على الزجاج. ضع coverslips في الفرن لتعيين 80 درجة مئوية لمدة ساعة.
- بينما يتم علاج coverslips ، تزن 500 من أصل ديكستران ويعد 30 ٪ ث / ت الحل. والتسخين الماء المساعدات الحل. سوف نستخدم حوالي 1 مل من هذا الحل في ساترة. مرة واحدة في ديكستران قد حلت ، defoam الحل في مجفف فراغ.
- عندما coverslips silanized الانتهاء من علاج ، إزالتها من رفوف السيراميك وترتيبها على شقة داخل مربع الفريزر البلاستيك. استخدام ماصة 1 مل لتغطية السطح العلوي من كل ساترة مع 1 مل من محلول ~ ديكستران. إغلاق مربع الثلاجة وتترك في مكان هادئ لل24-36 ساعة.
- في حين استيعاب coverslips مع ملقط من البلاستيك ، صب قبالة ديكستران الزائدة وتحل محلها في رف السيراميك. شطف عدة مرات coverslips في الماء ، والسماح للcoverslips لنقع في الماء لمدة 48 ساعة. قد تكون الجرة تحريكها بلطف على محور دوار فوق المنضدة.
- تجفيف coverslips في الفرن لتعيين 80 درجة مئوية وتخزينها في مجفف فراغ.
إعداد الحويصلية
تتشكل طبقات ثنائية الدهون التي تدعمها التكثيف الليبوزومات إلى ساترة ديكستران functionalized. فتيل الليبوزومات مع بعضنا البعض حتى كثف تمزق الغشاء وينتشر على سطح مستو.
- وهناك صيغة نموذجية الحويصلية المستخدمة في فحص وتتألف من 1،2 ، dioleoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DOPC) ، 1 - oleoyl - 2 - بالميتويل - SN - glycero - 3 - phosphocholine (POPC) ، والكولسترول ، والدماغ البقري Disialoganglioside (GD 1A) ، وN - 6 ((-- (biotinoyl) الأمينية) hexanoyl) -1،2 - dihexadecanoyl - SN - glycero - 3 - phosphoethanolamine في نسبة 4:4:2:0.1:5 X10 -5. يتم تخزين كافة المكونات في الكلوروفورم أو الكلوروفورم والميثانول الحلول.
- تحضير خليط micromoles تحتوي على اثنين من الدهون عن طريق نقل مجلدات من كل مكون في الزجاج أنبوب اختبار. يتبخر المذيب تحت تيار من غاز النيتروجين أو الأرجون. إزالة المذيبات المتبقية من خلال ترك أنبوب اختبار في مجفف فراغ لمدة ساعتين.
- Resuspend الفيلم الدهن المجفف في 400 من microliters العازلة HNE (HEPES 5 مم ، 145 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 0.1 ملم).
- نقل إلى تعليق microcentrifuge أنبوب من البلاستيك. تجميد تعليق في حمام النيتروجين السائل وذوبان الجليد في حمام ماء دافئ. تكرار هذه الدورة تجميد / الذوبان أربع مرات.
- تجميع الطارد الدهون مع 100 نانومتر تصفية الغشاء البولي ، وقذف تعليق الدهون 25 مرة. ينبغي للتعليق على ما يبدو أكثر شفافية بعد قذف.
- وينبغي أن تستخدم الليبوزومات في اليوم انهم مستعدون. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها.
ميكروفلويديك إعداد تدفق الخلية
يتم إجراء بسيط خلية تدفق ميكروفلويديك التي يقحم عصا الشريط المزدوج بين شريحة الكوارتز وساترة functionalized.
- الحصول على شريحة ملم 20x20x3 الكوارتز. استخدام الماس للدغ بحفر بئرين 1 ملم ثقوب على طرفي نقيض.
- قطع مربعة 20 ملم من ورقة العصا من الشريط المزدوج ، واستخدام شفرة الحلاقة ، قطع لمدة 15 مم 2 الجزء العاشر من المركز.
- تقشر جانب واحد من النسخ الشريط ، وتلتزم الشريط إلى الكوارتض الشريحة. يلتزم الجانب الآخر إلى ساترة functionalized.
- قطع أطوال الطول two 20 من أنابيب البولي اثيلين وإدراجها في ثقوب في الشريحة الكوارتز.
- ختم الخلية مع تدفق الغراء الايبوكسي 5 دقائق.
- عندما الغراء قد شفي ، رئيس الخلية وأنابيب مع تدفق العازلة.
- ويمكن تشكيل لدعم طبقة ثنائية المادة الدهنية في هذه المرحلة عن طريق رسم حوالي 80 microliters لتعليق الحويصلية في القنوات.
فيروس الجسيمات الوسم
- وعادة ما تستخدم H3N2 أنفلونزا A (X - 31) للمقايسة الانصهار ، ولكن تم استخدام سلالات الانفلونزا الاخرى والفيروسات الأخرى بنجاح.
- يسمى الفيروس مع ما يصل الى الأصباغ الفلورية two مختلفة للسماح للكشف عن تشكيل hemifusion والمسام.
- حل sulforhodamine ب (SRB) في المخزن HNE لجعل حل 20 ملم. تجمع 20 microliters من محلول الصبغة مع 10 microliters لتعليق الفيروسية ، وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ساعة. خلال هذه الفترة ، سوف تتراكم ببطء صبغ داخل جزيئات الفيروس.
- إزالة الصبغة عن طريق تمرير وقف الفيروس من خلال عمود PD - 10 تحلية. إذا تم استخدام المواد الفيروسية بما فيه الكفاية ، يمكن أن ينظر الفرقة الملونة في العمود. هذا الشريط يحتوي على الفيروس المسمى ويمكن جمعها كما هو eluted عليه.
- إذا لم يكن مرئيا الفرقة ، وجمع الكسور ميكروليتر 200 وتحديد الكسور التي تحتوي على الفيروس المسمى بقياس 565 نانومتر على امتصاص الطيف الضوئي. وينبغي أن الفيروس أزل في الحجم الكلي حوالي 0.8 مل.
- تسمية المغلف الفيروسية وذلك بإضافة 13 من microliters formamide a ثنائي ميثيل 2 ملم (DMF) حل رودامين octadecyl 110 (Rh110C18) لهذا الفيروس المسمى SRB تعليق.
- تحريك تعليق عن طريق ربط الأنبوب إلى المدورة المختبر ويترك لمدة 3 ساعات.
- تنقية الفيروس من Rh110C18 الزائدة باستخدام PD - 10 تحلية العمود كما هو موضح من قبل.
التكوين المجهر
يتم تنفيذ هذه التجربة على مجهر مضان مجهزة الهدف NA الغمر النفط المرتفعة مناسبة للتفكير الداخلي الإجمالي المجهري مضان. وتستخدم خطوط 488 و 568 نانومتر ليزر من غاز الارجون / الكريبتون لإثارة الفيروس المسمى Rh110C18 وSRB. ويتم إنجاز التصوير في وقت واحد كل تسمية عن طريق تقسيم الانبعاثات الأخضر والأحمر مع مضان مرآة مزدوج اللون ، والتركيز بشكل مستقل من الصور على نصفين منفصلين من كاميرا CCD ضرب الإلكترون.
أداء الفحص
تنفيذ مقايسة الاندماج ينطوي على تجميع تدريجي لعناصر الكيميائية الحيوية داخل الخلية التدفق : التجمع من طبقة ثنائية الدهن مستو ، التحام جزيئات الفيروس المسمى ، طلاء السطح مع فلوريسئين ، والشروع في التفاعل مع العازلة انخفاض الرقم الهيدروجيني (الشكل 1A) .
- جبل تدفق الخلايا على خشبة المسرح المجهر ، وإرفاق منفذ أنابيب ضخ حقنة لضبط تدفق بمعدل 40 microliters في الدقيقة الواحدة.
- مسح قنوات تدفق الليبوزومات الزائدة التي تتدفق في 300 من microliters HNE.
- التركيز المجهر وضبط قوة الليزر لإلقاء الضوء على السطح مع 2 واط / سم 350 من 488 نانومتر الخفيفة و 70 واط / سم 2 للضوء نانومتر 568. إذا كنت تستخدم 1.45 NA الغمر النفط 60x الهدف ، تعيين شدة الليزر إلى 100 واط و 20 واط الصغيرة متناهية الصغر ، على التوالي.
- مضخة الفيروس المسمى (مخفف 1 / 100) في خلية التدفق. ذلك أن الفيروس ينتشر على السطح السفلي للقناة التدفق ، وسوف تبدأ الجزيئات التمسك غانغليوزيد إدراجها في طبقة ثنائية المادة الدهنية.
- عندما تم التوصل إلى كثافة مناسبة من جزيئات الفيروس رست (تصل إلى حوالي 1000 الجزيئات في مجال الرؤية). تبديل أنابيب مدخل إلى حل تحتوي على اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر streptavidin فلوريسئين المسمى. سوف streptavidin المسمى ربط جزيئات الدهون إلى جانب البيوتين في طبقة ثنائية ، وفي النهاية خلفية خضراء قاتمة سوف تكون مرئية.
- غسل قناة تدفق microliters مع 300 من HNE.
- اختيار مساحة التصوير ، والتركيز المجهر وإعداد الكاميرا لالتقاط صور CCD الوقت ساقطا. ضبط وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية وجمع الإطارات بمعدل 10 هرتز.
- بدء الانصهار التي تتدفق في وجود مخزن مؤقت الحمضية التي تحتوي على 10 ملي سترات الصوديوم وكلوريد الصوديوم 140 ملم. ينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني للعازلة لتكون أقل من درجة الحموضة الحرجة من الفيروس الذي يعاير. X - 31 الصمامات في درجة الحموضة في أقل من 5.5.
ممثل النتائج
1B يوضح الشكل لقطات من طبقة ثنائية virions رست قبل وأثناء الانصهار. كل بقعة محدودة يمثل حيود جسيمات الفيروس الفردية. وقد الأحمر والأخضر ومضان تصوير منفصل على نصفي العلوي والسفلي من كاميرا CCD ، والسماح للمراقبة في وقت واحد من المغلف الفيروسية وتسميات المحتوى. وعادة ما تكون هناك نقاط ضعف كثيرة في قناة خضراء مقارنةالأحمر ، وهذا يعكس انخفاض كفاءة العلامات التي الصبغة المحتوى مقارنة مع تسمية المغلف. ومضان خلفية خضراء تنبعث من سطح ملزمة فلوريسئين يختفي فور وصول العازلة سترات ويسمح تحديد وقت بدء رد فعل الانصهار. تم الكشف عن الأحداث Hemifusion ورشقات نارية من مضان أخضر كما تطفئ Rh110C18 ينشر في المغلف الفيروسية عبر السويقة hemifusion والمخفف في الغشاء مستو. ويمكن رؤية سحابة من الخارج الفلورسنت توسيع hemifused حول جزيئات ، مما يدل على انتشار خالية من الصبغة ، أسيل الدهنية مرتبط في الغشاء مستو. ويلاحظ تكوين المسام واضمحلال مضان أحمر SRB من المحاصرين داخل المناطق الداخلية من الجسيمات الفيروسية. افتتاح المسام الانصهار يسمح للصبغة للهروب الى الفضاء المائي تحت طبقة ثنائية مستو والخروج من منطقة المراقبة.
مسارات كثافة مضان لكل جسيم ، تآمر من شدة متكاملة من الجزيئات الفردية ، وتسهيل تحديد العائد وأوقات hemifusion وتشكيل المسام (الشكل 1C). يتم تحديد أوقات الحدث Hemifusion وتشكيل المسام والنقطة التي المنحدر من أقصى انفجار Rh110C18 مضان أو SRB تسوس إشارة يحدث. في تجربة ناجحة ، على بعد حوالى 50 في المئة من الجسيمات المسمى مع إشارات Rh110C18 dequenching الغلة ، و 30 في المئة من الجزيئات SRB المسمى إعطاء إشارة صالحة للاستخدام. من الجسيمات المسمى مع كل من الأصباغ ، ما يقرب من 10 في المئة على حد سواء تظهر اشارات الدهون خلط وتشكيل المسام.
التين. 2A - C يوضح توزيع hemifusion والأوقات تأخر تشكيل المسام من تجربة نموذجية. Fig.2D - F يبين توزيع حدث من الأحداث مجتمعة من خمس تجارب أجريت في ظل نفس الظروف. حتى مع وجود عدد من الملاحظات المتواضعة ، على شكل رسوم بيانية واضحة. بسبب تزامن كل تجربة من خلال الكشف عن الرقم الهيدروجيني وقت هبوط ، يمكن الجمع بين التجارب المتعددة ويمكن الحصول على معلومات مفصلة عن معدل الحد من الخطوات الوسيطة.
الشكل 1. التصميم التجريبي. أ) وصفت جسيمات فيروس مع اثنين من الأصباغ الفلورية لرصد حركية hemifusion والانصهار تشكيل المسام. يتم جمعها من قبل الهدف مضان المجهر عالية NA وتصويرها في الصعود إلى اتفاقية مكافحة التصحر. B) الإسفار الصور قبل (يسار) وخلال الفترة (يمين) والانصهار من الجسيمات الفيروسية الفردية. النصف العلوي والسفلي من كل صورة تتوافق مع مضان أحمر وأخضر ، على التوالي ، في المنطقة ~ 50 × 100 مم 2 نفسها من طبقة ثنائية معتمدة. C) وكثافة مضان من التتبع SRB الحمراء محتوى الفيروسي (تتبع العلوي) ، وصبغة خضراء Rh110C18 غشاء (وسط التتبع) ، وجهاز استشعار درجة الحموضة فلوريسئين (أقل التتبع) توفير الدقيق مرات المنقضي بين انخفاض الرقم الهيدروجيني ، hemifusion ، والانصهار. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2. حركية فيوجن فيروس fluorescently المسمى. توزيع الوقت المنقضي بين انخفاض الرقم الهيدروجيني وhemifusion (A ، D) وتشكيل المسام (B ، E). صعود واضمحلال التوزيعات تشير إلى وجود خطوات وسيطة متعددة. وتوزع بشكل كبير في الانتقال بين hemifusion وفتح المسام لاندماج الجزيئات الفردية ، مما يشير إلى معدل واحد منظم للخطوة. لوحات AC تظهر نتائج تجربة واحدة. ويتم تجميع لوحات مدافع من خمس تجارب منفصلة أجريت في ظل نفس الظروف. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن إعداد السوائل والدهون طبقات ثنائية مستمرة بدعم أمرا صعبا. وكميات ضئيلة من المواد الملوثة أو عيوب السطح منع انتشار طبقات ثنائية. تنظيف دقيق وترسب طبقة موحدة من ديكستران ضرورية.
يمكن التصوير لفترة طويلة من جزيئات الفيروس التبييض التسميات الفلورسنت أو تسبب لهم أن يصبحوا المعطل. ومن المعروف جيدا الصور والضرر من هذا النوع في التصوير الحيوي ومجالات جزيء واحد ، ويعتقد عموما أن تنبع من جيل من أنواع الأكسجين التفاعلية التي fluorophores متحمس. لتقليل الضرر الصور ، ونحن عموما لتقليل قوة الليزر الإثارة وتجنب التعرض لفترة طويلة قبل بدء التجربة. قد نضوب الأوكسجين من مخازن مع واحدة من عدة نظم الأوكسجين الكسح ذكرت مفيدة.
القدرة على الحصول على معلومات عن الدول الوسيطة عابرة يتطلب أن تكون متزامنة بدقة رد فعل الانصهار. معدل التدفق المستخدمة وحجم القتلى من الأنابيب وتدفق مدخل قناة الخلية هي العوامل التي يمكن أن تحد من التزامن. يبدأ الانصهار من خلال تبادل عازلة محايدة لدرجة الحموضة الحمضية. ومع ذلك ، باعتبارها منطقة عازلة الحمضية ينتقل عن طريق أنابيب مدخل إلى الخلية التدفق ، والتفاعل بين مخازن two يمزج من خلال نشر ويصبح تدريجيا أقل وضوحا. التدرج الحموضة الناتجة على سطح طبقة ثنائية يميل إلى طمس تحديد وقت البدء. علاوة على ذلك ، منذ الانصهار حركية تعتمد على تركيز بروتون ، يمكن أن تدرج درجة الحموضة في بداية التجربة تعقيد تفسير النتائج. في التجربة أثبتت هنا ، فإن حركية الانصهار أبطأ بكثير من الرقم الهيدروجيني وقت تمر بمرحلة انتقالية ، وتأثير التدرج لا تؤثر تأثيرا كبيرا على حركية الانصهار. نحن نعمل حاليا على إدخال تعديلات على خلايا لدينا تدفق من شأنها أن تسمح لنا رئيس الأنبوب مع مدخل المخزن المطلوب قبل تحويل تدفق في الخلية التدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد عمل المعاهد الوطنية للصحة منح AI57159 (لSCH) وAI72346 (لAMvO). SCH هو هوارد هيوز الطبي محقق المعهد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
